bradford法测蛋白浓度原理（蛋白系列课程蛋白质定量）

上次和大家分享了蛋白定量的Lowry法，今天先给大家介绍一下Bradford法。

实验原理

考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕红色，最大吸收峰在465nm，当与蛋白质结合时变为蓝色，其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数更大，在一定范围内反应液在595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，此时测定595nm处吸光度的增加量可以对蛋白进行定量；蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。（染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合）

实验器材和试剂

1. 可见光分光光度计，旋涡混合器。

2. Brandford贮存液：100 mg考马斯亮蓝G250 溶于 50 mL 95%乙 醇 中 ，然 后 与100 mL 85%磷酸混合，用双蒸水稀释定容至 1L。

3. 标准蛋白溶液：用牛血清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml的标准蛋白质溶液。

实验步骤一、标准曲线的制作

1. 取7支试管，1支作为空白（第1号），其余试管（第2-7号）按如下顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入:0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用双蒸水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合，涡旋不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除。

2. 加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG250试剂。PS:不可使用石英比色皿，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。

3. 用标准蛋白质量(mg)为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。（如图）

灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1ug。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

二、缺点

1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

2. 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有:去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N的酸干扰Lowary法一样)。

3. 标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

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