肺动脉cta与主动脉cta联合扫描 动脉性肺动脉高压全基因组关联研究进展

作者：朱治萩 孙晓琳 陈曦安 克江·安尼瓦尔 王明宇 杨苏乔

单位：首都医科大学附属北京朝阳医院呼吸与危重症医学科 北京呼吸疾病研究所

引用本文:朱治萩, 孙晓琳, 陈曦, 等. 动脉性肺动脉高压全基因组关联研究进展 [J] . 中华结核和呼吸杂志, 2022, 45(8) : 813-818. DOI: 10.3760/cma.j.cn112147-20220323-00227.

摘要

动脉性肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一类多种因素共同作用的复杂性疾病，包括特发性PAH、遗传性PAH和疾病相关的PAH等，由于具有高度遗传异质性，其临床特征及预后也具有较大差异。目前，PAH的具体发病机制尚不明确，疾病负担重，诊治方案仍有待探究，因此，研究PAH的遗传易感性对了解疾病的发生发展具有重要意义。随着全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）的发展，发现了大量与PAH发病机制、临床表型、治疗和预后相关的遗传变异。本综述总结了近年来，国内外使用GWAS开展PAH遗传易感性相关研究的应用进展，为深入探究PAH的发生发展和个体化防治提供新思路。

动脉性肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）属于肺动脉高压中的第一大类，以多种病因所致肺小动脉为主的肺动脉病变为病理特点，从而引起肺血管阻力和肺动脉压力增高。文献报道全世界成年人的PAH年发病率约为2.4/百万，患病率约为15/百万；在欧洲，人群的PAH年发病率和患病率分别为 5~10/百万和15~60/百万^［1］。尽管已使用各种靶向药物治疗，我国PAH患者5年生存率仍仅约50%^［2］。PAH的发生与遗传、个体、环境等多种因素关系密切，其发展涉及多种细胞、细胞外间质及细胞内信号转导通路的异常，但具体病因及发病机制仍有待探究。随着全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）在PAH中的应用，发现了大量易感基因或基因座，为进一步阐述PAH的发病机制提供了全新的思路。

GWAS近年来逐渐兴起，是在全基因组层面上，通过对大规模的群体DNA样本进行高密度遗传标记分型，如单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）或拷贝数变异等，探寻基因与疾病之间是否存在关联的研究方法。GWAS能够同时检测到外显子、内含子和调控序列，不受连锁不平衡的限制，因此全面揭示了与PAH发生强相关的基因及可能的发病机制，也可将多个基因关联起来探讨其间的联系，从而进一步应用于疾病的诊治及预防。自2013年，Liu和Morrell^［3］首次在肺动脉高压的研究中应用GWAS以来，截至2022年2月22日，通过查询Pubmed发现，共有41篇PAH的GWAS研究，其中主要为特发性肺动脉高压（idiopathic pulmonary arterial hypertention，IPAH）和遗传性肺动脉高压（heritable pulmonary arterial hypertension，HPAH），两类各占11项，发现大量SNP等遗传变异位点与PAH的发生发展相关。本文将主要从PAH的发病机制、临床表现与严重程度、治疗及预后4个方面阐述GWAS在PAH中的研究进展，以期为PAH基因和基因组学研究提供参考。

一、GWAS与PAH的发病机制

PAH包括IPAH、HPAH、药物和毒物所致肺动脉高压、疾病相关肺动脉高压、对钙通道阻滞剂长期有效的肺动脉高压、具有明显肺静脉闭塞症和（或）肺毛细血管瘤病（PVOD/PCH）的肺动脉高压以及新生儿持续性肺动脉高压^［1］。GWAS至今已发现20多个与各类PAH相关的基因，具有高度遗传异质性，通过一些共同的机制导致相似的病理改变。其中，骨形态发生蛋白（BMP）/转化生长因子（TGF）-β信号通路在各类PAH细胞的生长、增殖、凋亡中起重要调节作用，是PAH发病的核心。BMP和TGF-β两条通路通过在肺动脉平滑肌细胞（PASMC）内的相互制衡作用以及BMP途径在肺动脉内皮细胞（PAEC）内的抗凋亡作用一起维持肺血管稳态^［4］。

1.IPAH：多项GWAS研究发现IPAH发病主要依赖BMP/TGF-β信号通路，发动的基因包括生长分化因子2（GDF2）和衰老关键蛋白2（FBLN2）（表1）。Gräf等^［5］对欧洲6个国家1 048例患者进行GWAS，筛选出显著差异的新位点GDF2。其突变后，循环中的BMP9减少，通过BMP信号通路导致PAEC凋亡、PASMC增殖。GDF2与IPAH发病的关联在后来Hodgson等^［6］针对英国人群的GWAS研究中得到了验证。另一项对欧洲4 241例患者的GWAS分析^［7］提出FBLN2的错义突变p.（Asp982Tyr）等通过TGF-β信号通路促进PASMC增殖，导致IPAH。

2.HPAH：BMP/TGF-β信号通路在HPAH的发病中同样起重要作用。成人和儿童HPAH发病的首要易感基因是骨形态发生蛋白2型受体（BMPR2），是PAEC编码BMP/TGF-β信号通路中的膜受体成分，此基因突变使PAEC功能障碍，并促进其向间充质细胞转化。BMPR2突变约占HPAH的80%，占IPAH的20%，迄今在此基因处已检测到370多种不同的突变^［8］，其中研究最多的是rs1085307172等。在BMPR2常见突变位点被反复验证的同时，新的突变位点也不断涌现出来，例如Higasa等^［9］对日本人群的GWAS发现了跨越3个外显子的6.5千碱基的大缺失、9号内含子中的插入突变（NM_001204.6：c.1277-10_1277-9insGGG）等共8个新突变。

儿童HPAH发病的第二大易感基因是T盒4（TBX4）（7.7%），其突变在成人和儿童中都得到了验证。TBX4突变通过人成纤维细胞生长因子-10抑制BMP途径。Karolak等^［10］新发现了17q23.1q23.2位点约2.2 Mb 拷贝数变异缺失和TBX4上游非编码区70 kb内7个非编码SNP。结合之前的研究^［11］，后者为特异性增强子区域。一项天然排除了遗传多样性的GWAS研究对高海拔中亚吉尔吉斯高原居民进行了全基因组测序（WGS）^［12］，提出多个可能的候选基因：17号染色体上肌管蛋白相关蛋白4（MTMR4）、15号染色体上原肌球调节蛋白3（TMOD3）、热休克转录因子5（rs3803752和rs117817367）等。其中MTMR4在啮齿动物实验中被证实通过抑制PASMC中BMP信号通路促使血管增生。

除BMP/TGF-β信号通路外，Notch信号通路、K离子通道、核因子κB（NF-κB）等通路也会导致HPAH的发生。由于Notch信号通路与SRY盒转录因子17（SOX17）在PAEC中的相互作用，近几年再次成为HPAH发病的焦点。最具代表性的是一项大样本4中心GWAS队列研究中，Rhodes等^［13］筛选出新位点：SOX17上游 100~200 kb的增强子rs13266183 和rs10103692。SOX17在PAEC分化中作为 Notch 信号通路的上游直接激活Notch1启动子^［14］，而Notch信号通路的激活又可作为上游反向调节SOX17的转录后水平^［13］。K离子通道通过影响膜电位调节PASMC的舒缩活性和血流，导致HPAH的发病。欧美人群中钾通道亚家族K成员3（KCNK3）的突变（p.Gly203Asp）在日本人群中得到复制^［9］，均被证实为HPAH的高风险因素，提示它对HPAH发病的普适性。WGS在线粒体DNA（mtDNA）中的应用提示了mtDNA通过NF-κB通路与核基因相互作用，影响肺血管细胞凋亡导致HPAH。Farha等^［15］对美洲人全线粒体基因测序得出，M单倍体群是HPAH的风险因素，最原始的L单倍体群是保护因素。炎症相关通路中的小脑蛋白2前体基因（CBLN2）突变与IPAH和HPAH均相关^［16］，在PAEC中该基因过表达后，通过旁分泌作用使PASMC增殖（表1）。

3.其他类型PAH：其他类型PAH的GWAS研究相对较少，对发病机制的提示也有限（表1）。Huang等^［17］通过对中国人群系统性红斑狼疮（SLE）患者WGS发现，CBLN2rs2217560位点G等位基因突变的SLE患者并发PAH的风险增加近2倍，可能通过炎症等各类PAH的共同途径致病。真核细胞翻译起始因子2α激酶4（EIF2AK4）双等位基因突变是PVOD/PCH特有的^［18］，这种突变会导致tribbs样蛋白3减少，抑制BMP通路；同时，其编码的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能丧失，可能加重PVOD/PCH^［19］。一项研究^［20］对PAEC和PASMC进行WGS发现：PAEC以基因表达下调为主，下调基因与细胞外基质形成、胶原合成、细胞间黏附有关，上调基因与细胞因子信号转导及相互作用、胶原降解、基质金属蛋白酶的激活有关；PASMC内基因上调和下调量持平，上调基因与不饱和脂肪酸的合成与代谢有关。因此推测PAH的发病机制中存在内皮屏障破坏、通透性增加，以及能量驱动的PASMC增殖。

二、GWAS与PAH的临床表型及严重程度

近几年，越来越多的研究发现特定临床表现与PAH具有遗传相关性（表2）。导致每升肺泡容积的一氧化碳弥散量（Kco）低的基因包括EIF2AK4^［18］、KCNK3^［21］和激酶插入结构域受体（KDR）^［22］。导致诊断年龄小的基因包括EIF2AK4^［18］、SOX17、水通道蛋白1（AQP1）^［5］和HLAⅡ类组织相容性抗原DPα1链/DPβ1链（HLA-DPA1/DPB1）^［13］。但有些突变会导致特征性的临床表现，比如KDR突变患者诊断年龄大^［22］；EIF2AK4双等位基因突变者肺活量正常，且肺动脉血管扩张剂治疗预后差^［23］；AQP1突变患者的表型具有共分离现象^［5］。目前已识别的PAH致病基因都是不完全外显，而性别可能是外显率的重要调节因子^［7］。患者临床表型还会受相同基因的不同突变类型影响。Swietlik等^［22］的GWAS分析发现，KDR的无义突变才会出现Kco显著降低（低于33%）和诊断年龄大，而错义变异不表现出这两种特点。BMPR2框内缺失的慢性阻塞性肺疾病患者表现出严重的肺动脉高压相关症状^［9］。

PAH患者的临床严重程度与遗传突变的类型、数量以及基因本身作用相关（表2）。Navas Teiedor等^［21］对136例西班牙患者进行GWAS，发现KCNK3的纯合突变使得临床症状迅速恶化。Hadinnapola等^［18］对欧洲多国患者的GWAS发现，单独EIF2AK4的杂合突变与PAH严重程度无明显关系，但当合并有BMPR2突变时，两者互相影响改变了BMPR2突变外显率，导致临床表现加重。Iranmehr等^［12］发现TMOD3抑制PAEC迁移，延缓受损内皮的修复，加速PAH进展。某些突变还会使得PAH患者伴有肺部或全身性疾病。TBX4突变患儿多伴有精神发育迟滞、小髌骨综合征以及其他发育性肺疾病^［24］。Iranmehr等^［12］针对高原人群进行WGS，提出血管细胞黏附分子-1的突变会合并多种肺损伤性疾病和全身性疾病。值得注意的是，由于KDR通过VEGF信号通路发挥作用，VEGF受体酪氨酸激酶片段的抑制剂（如SU5416）以及贝伐珠单抗在治疗其他疾病时会导致PAH^［22］。

三、GWAS与PAH的治疗

鉴于GWAS在发现遗传突变位点、拷贝数变异、编码蛋白结构变异方面的优势，对于PAH治疗方法的探索已经遍布整个基因表达过程。越来越多的研究致力于根据GWAS靶向设计PAH的治疗药物（表3）。Kimura等^［25］发现IPAH患者PASMC中磷酸二酯酶1A的转录被激活，且临床实践证明PDE抑制剂有效。Kelly等^［26］使用GWAS对慢性高脂肪饮食诱导小鼠的基因进行筛选，再将筛选出的小鼠基因与人类基因进行同源性匹配，发现表皮生长因子受体调节PASMC的生长和增殖，是可能的药物靶点。但对不同类型的PAH，其治疗效果可能不同。

然而，有些基因不适合发展靶向药物，Zhu等^［7］对4 241例欧洲PAH患者进行的GWAS表明，血小板衍生生长因子D（PDGFD）的错义突变使该基因过表达，经分泌作用于PASMC。虽然酪氨酸激酶小分子抑制剂（如伊马替尼）可以靶向抑制PDGF通路，但会同时引起心脏成纤维细胞功能障碍，甚至凋亡^［27］。所以更理想的方式是用中和抗体或DNA/RNA适配体隔离PDGFD，或通过寡核苷酸阻止PDGFD-PDGFRβ相互作用^［7］。

比靶向治疗更简便的方式是药物替代治疗（表3），当基因突变导致分泌蛋白减少时，体外给予药物替代分泌蛋白功能的治疗方式具有可行性。Gräf等^［5］发现的GDF2突变，以及Hodgson等^［6］另外发现的BMP10突变都会致BMP9和BMP10分泌减少，体外给予BMP9和BMP10能够恢复血浆中BMP活性。更具有个性化治疗意义的是前列腺素I2合酶（PTGIS）突变的PAH患者。Wang等^［28］发现PTGIS突变后，前列环素的合成减少、血栓素A2过表达，而给这些有PTGIS变异的PAH患者吸入伊洛前列素，可显著降低肺血管阻力，增加心脏指数。

四、GWAS与PAH的预后

PAH的预后与肺血管重塑、炎细胞浸润、右心失代偿有关。BMPR2突变的HPAH患者，右心衰竭更明显^［29］，因为BMPR2信号传导异常会破坏内皮屏障，阻碍DNA修复，细胞脂肪酸氧化减少、糖酵解增加^{［30, 31］}，影响线粒体裂变及融合，不利于炎症消退^［32］。KCNK3突变影响肺血管功能的即时和长期调节^［32］。右心室功能比肺动脉压力更能有效地预测PAH的预后，合并右心功能不全的PAH患者预后更差。一些遗传位点会增加右心功能不全的易感性，如肝细胞核因子1B（HNF1B）影响心脏舒张功能^［33］，HNF1B和一氧化氮合成酶1接头蛋白等与心血管疾病的发生相关^{［33, 34］}，发状分裂相关增强子2附近的rs9388451突变易引发Brugada综合征^［35］。

有研究指出，免疫机制也可能是PAH生存率的重要影响因素。两项GWAS研究都发现遗传变异集中在HLA Ⅱ基因中（表4），HLA Ⅱ基因编码的MHC Ⅱ类分子参与呈递靶抗原。Rhodes等^［13］的一项大样本多中心研究发现，HLA-DPA1/DPB1中rs2856830的C纯合突变比T纯合突变平均生存时间更长（13.5年，6.97年）。C等位基因的Glu⁶⁹ 残基可能阻止了Ⅱ类抗原呈递蛋白的功能从而影响适应性免疫应答。Ulrich等^［36］对英国276例各类PAH患者进行WGS，通过与GWAS共定位率很高的表达数量性状位点基因功能富集分析发现，共有20个具有eQTL的PAH致病基因来自HLA Ⅰ、Ⅱ类（18例）以及HLA ⅠB类（2例）。此外，同一药物对不同基因表型患者会有不同疗效。在接受内皮素受体拮抗剂治疗的欧裔患者中，内皮素受体G蛋白γ亚基基因的T/T基因型比C/C和T/C型者病情改善更快且疗效更好^［37］。另外，生存率明显下降还见于Kco低于50%的KDR突变患者^［22］，而TBX4突变患儿的生存率较高^［24］。

综上所述，GWAS为PAH提供可能的遗传突变因素，为这一大类复杂疾病的研究指明方向。GWAS的应用进一步验证了BMPR2、BMP/TGF-β 信号通路在PAH发病中的重要作用，揭示了基因与PAH临床表型和生存率之间的密切联系，也为靶向治疗和功能替代治疗药物的应用提供了重要依据。然而，单纯进行GWAS将无法探知基因之间、基因与环境之间的相互作用，需要密切结合临床表型等多种因素加以分析。虽然已有研究在不同人群中对KCNK3、MTMR4等进行验证，但仍需要对其他基因进行针对不同遗传背景人群的大样本研究。此外，仅仅根据GWAS结果来理解或预测疾病风险仍存在不足，需要进一步灵活地结合更多技术和实验，例如表达数量性状基因座技术、整合表观遗传学及转录组学等，并对风险基因进行功能性研究。

参考文献（略）