体外培养的细胞如何抵御病毒（稳定细胞系悬浮培养工艺）

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细胞与基因治疗产品给患者带来了新的治愈希望，但是产品研发与生产成本居高不下，高昂的药物价格导致患者用不起药，制药企业也难以回收研发成本，陷入恶性循环。降低成本扩大生产是缓解问题的关键。

基于稳定细胞系 悬浮培养的慢病毒载体生产技术一方面降低了生产中的各项成本，减少了工艺步骤，使细胞治疗药物开发成本更可负担，另一方面提升了慢病毒载体的质量，更高效、更高水平地推动细胞与基因治疗药物完成临床、上市。未来，慢病毒载体生产技术的进步与更迭使细胞治疗药物开发成本更可负担。

载体分为病毒载体和非病毒载体两大类，目前88%的在研基因治疗药物递送系统使用病毒载体。但是病毒载体工艺以及大规模GMP生产的难度较高、产能短缺，成为了细胞与基因疗法药物开发的主要瓶颈之一。

慢病毒作为替代逆转率病毒的载体，保留了高表达效率和长表达时间的优点，还具备将其基因组整合到非分裂细胞中并进行转导、感染能力提升等优势。慢病毒载体生产工艺中，瞬时转染是主流的转染方式，瞬时转染能够将含目标基因的病毒质粒和多个用于辅助病毒生成的质粒递送给细胞（主要指HEK293细胞），质粒外源基因在细胞内发生转录翻译，得到少量的蛋白，导入的核酸仅在细胞中存在一段有限的时间，没有整合到基因组中，外源基因随着细胞的生长分裂逐渐丢失。

瞬时转染操作相对简单，可以在较短时间内生产病毒载体，但是转染过程中需要加入成本昂贵的质粒，质粒与细胞的结合具有随机性，引入了批间差的风险，瞬时转染会由于过量的质粒和残留的转染试剂而导致最终产品的污染风险。瞬时转染作为实验室技术，不适合工业化大规模生产需求。通过瞬时转染293T细胞的方法生产慢病毒载体占据细胞治疗生产成本的20%-30%，占据基因治疗生产成本的50%以上。

基于稳定细胞系生产慢病毒载体的工艺是将目标基因及病毒包装基因插入生产细胞系，构建可以稳定表达生产目标病毒的细胞系，当细胞系被扩增到一定数量时，无需转染就可以直接生产病毒载体。稳定转染通常是适应悬浮的细胞系，不需要基质附着、生长和生产病毒载体，“稳定细胞株转染 无血清悬浮生产”工艺是解决慢病毒载体生产困境的有效方式，能够避免多质粒转染，且无需使用质粒，简化了生产步骤，降低了生产成本，满足大量、长期的生产。

病毒载体通常是由四至五种蛋白协同包装出来的有效病毒颗粒，多基因的插入策略以及筛选方法较为困难。慢病毒载体的包膜基因具有一定的毒性，细胞表达的时候会导致细胞本身的凋亡，因此很难做到蛋白高表达，而稳定细胞系需要细胞系存活且传代，细胞系的高通量筛选还需要引入自动化体系，以及实现无血清的悬浮工艺。

因此，稳定细胞系的构建以及基于该工艺的慢病毒载体生产在实际的生产平台搭建和商业化应用中存在一定的技术门槛。我国本土企业深研生物研发了首个商业化无需质粒瞬时转染的慢病毒载体生产系统EuLV，深度优化了基因编辑、分子开关等分子生物学技术，设计并实现了独有的高通量细胞自动化筛选工作站，并结合了大数据分析、生物信息学等技术，实现商业化生产。EuLV将慢病毒载体的现有生产效率提高100倍，把生产成本降低80%以上，并提高慢病毒载体的质量、增强稳定性、减少批间差。

目前行业中较为突出的慢病毒载体生产服务商有国外的Lonza、Thermo Fisher、Oxford Biomedica、Oxgene（被药明生基收购）、CCRM，国内的深研生物、蓬勃生物等企业。

Lonza是全球CDMO巨头，也是全球最大的专用细胞和基因疗法制造工厂，全球范围内合作客户超过200个、工艺开发项目大于120个，提供基于瞬时转染和稳定细胞系表达的慢病毒载体生产服务。

Thermo Fisher作为全球知名生物技术和医疗器械公司，通过收购方式不断扩大自身在病毒载体领域的生产技术和能力，提供基于瞬时转染和悬浮培养技术的慢病毒载体生产服务。

Oxford Biomedica拥有行业领先的慢病毒载体递送系统平台，与许多生物医药公司建立了广泛的合作伙伴关系，其中与诺华合作的Kymriah是首个获得FDA批准的慢病毒载体疗法。

Oxgene被药明生基收购，与药明康德的CDMO业务相结合，具有较强的竞争力。

国内企业中，深研生物的慢病毒生产技术基于稳定细胞系工艺，而蓬勃生物的慢病毒载体生产基于瞬时转染工艺。通过瞬时转染技术生产慢病毒载体的应用发展较早，但是基于成本和产量的考虑，慢病毒载体生产服务商也正不断探索通过稳定细胞系生产慢病毒载体并商业化的方式。

近年来，随着技术的不断改进，基因治疗的安全性和有效性得到提升，在多种遗传性罕见病，如血友病、脑白质营养不良、杜氏肌营养不良症及先天性黑蒙症等的临床治疗中取得突破成果。此外，CGT临床试验应用领域逐渐扩大，对于糖尿病、心血管等慢性疾病以及艾滋病等传染性疾病的应用也在增加，为这类疾病的治愈带来希望。CGT最初主要应用于探索针对遗传性疾病治疗，现正广泛应用于恶性肿瘤、感染性疾病、心血管疾病以及自身免疫性疾病的治疗中。

全球及中国在研的基因治疗临床试验均集中在肿瘤和感染性疾病领域；全球的适应症更为广泛，中国临床试验的治疗领域存在进一步扩展的空间。根据美国生物技术创新组织机构（BIO）发布的2011-2020年临床研发成功率数据，基因治疗从临床Ⅰ期到获批上市的概率约为10%，CAR-T高于基因治疗，约为17%。基因治疗从临床Ⅱ期到获批上市的概率约为19%，而CAR-T约为39%。对于基因治疗和CAR-T从临床Ⅲ期到获批上市的概率分别为50%和67%。中国临床试验主要处于临床Ⅰ期阶段，CGT的研发尚处于早期；但临床Ⅲ期的比例相较全球较高，预计在进行的临床试验中研发上市成功的比例也会较高，未来中国CGT产品商业化将加速。

需求层面上，中国作为人口大国，罕见病及肿瘤等患病人数众多，存在大量尚未被满足的医疗需求。罕见病患者人群巨大的市场需求以及基因治疗为这些疾病领域带来的希望成为了基因治疗市场的重要驱动力。

政策层面上，国家对于CGT产业的鼓励态度十分明确，国家和各级政府持续出台产业鼓励政策，支持细胞与基因治疗行业整体的发展，加强技术平台的建设和新型药物的研发。

CGT行业火热发展也带动了慢病毒载体生产行业的进步。CGT产品研发和生产，将会带来更多的慢病毒载体需求，因此，如何提高慢病毒载体的生产能力、降低慢病毒载体的生产成本成为重要方向，更高效、低价的慢病毒生产系统也会受到CGT行业中企业和研究机构的更多关注。

细胞与基因治疗产品给患者带来了新的治愈希望，但是产品研发与生产成本居高不下，高昂的药物价格导致患者用不起药，制药企业也难以回收研发成本，陷入恶性循环。降低成本、扩大生产是缓解问题的关键。

基于稳定细胞系 悬浮培养的慢病毒载体生产技术一方面降低了生产中的各项成本，减少了工艺步骤，使细胞治疗药物开发成本更可负担，另一方面提升了慢病毒载体的质量，更高效、更高水平地推动细胞与基因治疗药物完成临床、上市。未来，慢病毒载体生产技术的进步与更迭使细胞治疗药物开发成本更可负担。