蛋白质在细胞合成轨迹 茫茫质海

伯小远想先问大家个问题：单个基因翻译的蛋白是否会定位在不同的亚细胞器上？相信大家给出答案的是——会！那有哪些原因会使蛋白选择换个“家”住呢？今天我们就来一起研究一下吧。读完本文，你会对亚细胞定位实验中出现的很多“反常”情况有更多解释和思考的方向，同时，你将会对以下问题有新的认识：

关于亚细胞定位

subcellular localization

1不同转录本翻译的蛋白是否会影响定位？

2转录因子一定定位在细胞核？

3一个氨基酸的突变就能影响蛋白的定位？

4GFP连在蛋白的N端或C端，蛋白定位的结果一定相同吗？

5蛋白一定是均匀分布在膜上吗？

同一种蛋白在不同亚细胞器定位的原因

NO.1 选择性剪接

与韧皮部发育有关的转录因子基因AtAPL（At1g79430）的选择性剪接将产生两个具有不同5’端的转录本（图1）：第一种转录本编码较少的氨基酸，在其末端有一个线粒体靶向序列（MTS），翻译后的蛋白定位于线粒体（图2）；第二种转录本编码较多的氨基酸，在其MTS序列的N端还有一段氨基酸，翻译后的蛋白定位于细胞核（图3）。

图1 AtAPL的选择性剪接产生两种转录本 (Duchene & Giege, 2012)。

图2 APL编码的较短蛋白质与GFP的N端融合后定位于线粒体 (Carrie et al., 2009)。

图3 APL与APL pro::GFP融合后定位于细胞核 (Bonke et al., 2003)。

NO.2 翻译后修饰：蛋白磷酸化/去磷酸化

栗子一

在植物中，磷酸盐是植物吸收磷的唯一形式，磷的吸收主要由定位于质膜上的磷转运蛋白（Phosphate transporters，PTs）介导，该转运蛋白属于PHOSPHATE TRANSPORTER1（PHT1）转运蛋白家族。蛋白磷酸化是一个可逆的过程，由蛋白激酶和蛋白磷酸酶两种拮抗酶催化。蛋白磷酸酶OsPP95和蛋白激酶CK2拮抗调控PTs的磷酸化状态，影响PTs从内质网向质膜的转运，进而调控植株体内磷的平衡（图4）。由此可见，蛋白的磷酸化状态对蛋白亚细胞定位的影响极其重要。

图4 PP95调节PTs从内质网向质膜转运的信号通路模型 (Yang et al., 2020)。在磷充足的条件下，蛋白激酶CK2全酶（CK2α3与磷酸化的CK2β3一起）使PTs磷酸化，从而抑制它们与磷酸盐转运蛋白运输促进因子PHF1的相互作用，进而抑制其向质膜转运。此外，PHO2会降解PP95，防止其使PTs去磷酸化。因此，质膜上只有很少的PTs。在磷缺乏的条件下，CK2β3被降解，PHO2被下调，使PP95稳定并使PTs去磷酸化。去磷酸化的PT在PHF1的帮助下离开内质网，然后被运输到质膜。因此，就会有更多的PTs靶向质膜，从而有助于磷的吸收。

栗子二

EIN2蛋白是乙烯信号传导过程中的重要蛋白，在乙烯的信号传导中发挥正调控作用。在研究初期，EIN2被发现定位于内质网中（图5）。

图5 EIN2蛋白的亚细胞定位 (Bisson et al., 2009)。（A）EIN2-GFP蛋白；（B）内质网Marker蛋白；（C）将前两张图片重叠；（D）用DAPI染色细胞核；（E）EIN2-GFP显示定位于围绕在细胞核外典型的内质网上；（F）将前两张图片重叠。

2012年8月，Joseph R. Ecker实验室在Science期刊发表了题为“Processing and subcellular trafficking of ER-tethered EIN2 control response to ethylene gas”的文章，揭示了EIN2由内质网到细胞核转移的机制。

该团队通过保守结构域预测，发现在EIN2的C端有一个核定位信号（NLS），那么EIN2可能会定位在细胞核吗？亚细胞定位结果显示使用乙烯前体ACC（1-氨基环丙烷羧酸）处理样品会使EIN2由内质网转移至细胞核（图6）。

图6 乙烯对EIN2亚细胞定位的影响 (Qiao et al., 2012)。在没有使用乙烯前体ACC的情况下，EIN2-GFP定位于内质网（C），但使用ACC处理后，EIN2-GFP定位于细胞核（D），并且随着处理时间的延长（0、10、20、30min），细胞核内会聚集越来越多的EIN2蛋白。

后续的实验表明EIN2是一种双功能的蛋白，当有乙烯存在时，EIN2被蛋白水解酶剪切后，其C端片段（CEND）会转运至细胞核发挥作用，剪切位点位于C端的S645位置（图7），而这其实也是由于CTR1蛋白激酶对EIN2的磷酸化修饰才使EIN2的C端被剪切入核 ( Ju et al., 2012; Qiao et al., 2012; Wen et al., 2012)。

图7 EIN2蛋白的结构 (Li et al., 2015)。EIN2含有7个内含子，其N端具有12个跨膜结构域。后来的研究发现，乙烯-CTR1信号通路中CTR1可以磷酸化EIN2-S645/S924位点（是的，不止正文中所述S645这一个位点噢），并抑制EIN2的C端片段（CEND）的质-核穿梭；当有乙烯时，EIN2-S645/S924位点的磷酸基团被去除，导致EIN2被剪切，EIN2 CEND在核内富集。

现在，伯小远留道思考题：如果我们用EIN2做亚细胞定位实验，将GFP融合在它的N端或C端，一定会得到相同的定位结果吗？S645剪切位点的存在会使蛋白断裂而导致出现不同结果吗？

同学们可以在文章后面留言！

2015年，北京大学郭红卫课题组在Cell期刊发表了题为“EIN2-directed translational regulation of ethylene signaling in Arabidopsis”的文章，揭示了EIN2如何抑制EBF1/2的功能（图8）。对乙烯信号传导感兴趣的同学可以多看一下该实验室的其它文章呦！

图8 乙烯信号传导途径 (Li et al., 2015)。当没有乙烯时，细胞核中的EIN3/EIL1会被F-box蛋白EBF1/2介导的泛素化/蛋白酶体途径快速降解，抑制下游乙烯相关基因的表达。当有乙烯时，EIN2 CEND被蛋白酶从内质网上切割下来，细胞质中的EIN2 CEND可以和EBF1/2 mRNA的3’UTR互作，并且通过和定位于细胞质的P-body中的组分互作，将EBF1/2 mRNA带入P-body，从而抑制EBF1/2 mRNA的翻译，EIN2 CEND进入细胞核，稳定EIN3/EIL1并使其积累，激活下游乙烯信号。

NO.3 翻译后修饰：法尼基化

2008年，Wilhelm Gruissem实验室在Plant Physiology期刊发表了题为“Farnesylation Directs AtIPT3 Subcellular Localization and Modulates Cytokinin Biosynthesis in Arabidopsis”的文章，揭示了AtIPT3由质体到细胞核转移的机制。

蛋白质法尼基化修饰是指在目标蛋白质的羧基末端的CaaX基序的半胱氨酸残基（Cys）上添加15个碳的法尼基异戊二烯。

拟南芥中细胞分裂素生物合成的第一步是由磷酸腺苷-异戊烯基转移酶（AtIPT）催化的。AtIPT3位于质体中，因为该蛋白质的前55个氨基酸是叶绿体转运肽（Transit peptide，TP），该TP足以将GFP引导至质体（图9A）。为了研究法尼基化对AtIPT3亚细胞定位的影响，在洋葱表皮细胞瞬时表达TP-GFP（A）、GFP-AtIPT3C333S（B）、TP-GFP-AtIPT3C333S（C-F）和TP-GFP-AtIPT3（G-M）。AtIPT3包含完整的野生型CLVA基序，AtIPT3C333S是指将CLVA突变为SLVA，即半胱氨酸突变为丝氨酸，导致AtIPT3无法被法尼基化。亚细胞定位结果显示，AtIPT3的法尼基化会将大部分蛋白质导向细胞核（图9）。

图9 法尼基化影响AtIPT3的亚细胞定位 (Galichet et al., 2008)。TP-GFP-AtIPT3C333S定位在质体中（图C-F），而缺乏TP（GFP-AtIPT3C333S）导致蛋白质定位在细胞质中（图B）。相比之下，TP-GFP-AtIPT3在转化后16h主要定位于细胞核（图H-K），然而，在24h后该蛋白也定位于一些细胞的细胞质中（图L、M）。类似地，在转化细胞的细胞核和细胞质中也发现了GFP-AtIPT3。总之，尽管存在叶绿体TP，但AtIPT3的法尼基化会将大部分蛋白质导向细胞核。

NO.4 和其他蛋白的相互作用

2018年，浙江大学毛传澡实验室在New Phytologist期刊发表了题为“Rice SPX6 negatively regulates the phosphate starvation response through suppression of the transcription factor PHR2”的文章，揭示了水稻SPX6蛋白作为磷（Pi）饥饿信号响应途径负调控因子的作用，完善了磷元素响应的信号传导途径。

该团队在烟草叶片中瞬时共表达35S-SPX6-GFP和35S-PHR2-mcherry。结果发现与SPX6-GFP共表达的PHR2-mcherry在细胞核和细胞质中均表达，而在对照组中，PHR2-mcherry主要定位于细胞核（图10c）。这表明与PHR2有相互作用的SPX6改变了PHR2的亚细胞定位，这种改变直接影响了对基因功能的调控（图11）。

图10 SPX6的过表达致使PHR2的亚细胞定位发生改变 (Zhong et al., 2018)。（a）亚细胞定位实验表明SPX6定位在细胞核和细胞质；（b）BiFC实验表明，SPX6和PHR2在细胞核和细胞质中均能发生互作；（c）在烟草叶片中瞬时共表达35S-SPX6-GFP和35S-PHR2-mCherry，发现SPX6可以改变PHR2的亚细胞定位。

图11 SPX4和SPX6调节磷信号的工作模型 (Zhong et al., 2018)。当磷充足时，SPX4和SPX6在细胞质与PHR2结合，抑制PHR2的质-核转移，在细胞核中，SPX6也能与PHR2结合，抑制PHR2对下游PSI基因的激活能力，保持PSI低表达；缺磷时，SPX4和SPX6被泛素化降解，PHR2被释放并进行质-核转移，在核中，与PSI基因启动子上的P1BS基序结合，激活PSI的表达，促进磷的吸收。

NO.5 一个碱基的突变

2019年，湖南农业大学武涛实验室在Journal of Experimental Botany期刊发表了题为“PINOID is required for lateral organ morphogenesis and ovule development in cucumber”的文章，揭示了黄瓜突变体r1中蛋白激酶PINOID（PID）一个氨基酸的突变导致其影响了生长素的转运，进而影响器官形态发生和胚珠发育。

该团队发现突变体r1的CsPID基因第二个外显子上的G突变成了A（图12），该突变位点可能通过改变其蛋白激酶PKD1的活性进而影响CsPID的功能。在烟草叶片中分别瞬时表达pSuper::CsPID-eGFP和pSuper::Cspid-eGFP。结果发现，CsPID以连续模式定位于细胞和细胞核的外围，而Cspid以点状模式定位于细胞和细胞核的外围（图13）。这表明即便是一个碱基的突变带来的氨基酸突变，也会改变蛋白的亚细胞定位并最终影响蛋白的功能。

图12 突变体r1的CsPID基因第二个外显子上的G突变成了A (Liu et al., 2019)。

图13 在烟草叶片中分别瞬时表达pSuper::eGFP、pSuper::CsPID-eGFP和pSuper::Cspid-eGFP (Liu et al., 2019)。

一些“反常”的定位

Q1. 同源蛋白一定定位在相同的亚细胞器？

不一定。倒过来想，同源蛋白就一定发挥相同的功能吗，答案是否定的，那就很好理解同源蛋白为何不一定定位在相同的亚细胞器上了。所以，千万不要用同源蛋白的定位结果来进行假设喔。

Q2. 蛋白一定是均匀分布在膜上吗？

不一定。一些蛋白是有极性的，例如生长素转运蛋白PIN-FORMED（PIN）不对称地定位在质膜上（图14）。类似的，还有其他激素转运蛋白、光受体蛋白、通道蛋白等等。

图14 PIN1在根维管细胞中的定位情况，以及其在中柱鞘（P）和内皮层细胞（En）的定位情况 (Ki et al., 2016)。可以看出，PIN1在细胞质膜上的分布是不均匀的。

Q3. 转录因子一定定位在细胞核？

不一定。前文给出了例子，转录因子AtAPL由于选择性剪接定位于线粒体或细胞核中，我们上一期的文章中也有类似的例子。

伯小远叨叨

再回到开篇提出的问题：单个基因翻译的蛋白是否会定位在不同的亚细胞器上？蛋白亚细胞定位的改变一定伴随着其功能的改变，所以这个问题就等于是问某个蛋白一定只有一种功能吗？在转录水平上，可能由于基因产生了不同的转录本，在翻译水平上，可能由于蛋白受到了各种修饰（磷酸化、乙酰化、泛素化、甲基化、糖基化、法尼基化等，伯小远仅列举了其中两个），这些原因都会使蛋白在改变功能的同时也改变其亚细胞定位，而上述“和其他蛋白的相互作用”、“一个碱基的突变”也包含在这些原因之中，单列出来是为了让大家能记的更深刻。当然，除了这些原因，也可能是多个靶向信号之间的竞争、靶向信号被修改或效率低等，欢迎大家来补充喔！

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