对于家禽球虫病的研究论文（论文推荐仁扇舟蛾幼虫肠道可培养细菌群落结构分析）

原创 朱 晗等 南京林业大学学报

论文推荐

仁扇舟蛾幼虫肠道可培养细菌群落结构分析

朱 晗，郝德君*，魏原芝，孙丽昕，文全民

南京林业大学林学院，南方现代林业协同创新中心。

昆虫在长期协同进化过程中，与病毒、细菌、真菌、原生动物等多种微生物相互选择、相互适应，形成了密切的共生关系。研究表明，昆虫肠道细菌具有多方面的功能，如调节营养代谢帮助宿主分解难以降解的食物变为易于消化吸收的组分；直接 为宿主昆虫提供必需氨基酸、维生素等营养物质；分解代谢产生短链脂肪酸（SCFAs）等代谢副产物影响宿主昆虫的脂质和碳水化合物代谢，维持稳态；调控激素的信号途径从而影响宿主昆虫的生长发育及其寿命；降解杀虫剂，保护宿主免受毒害；参与肠道干细胞增殖和上皮细胞再生的生理活动；参与昆虫信息素的合成，调控宿主昆虫种间通讯及种群行为；引起宿主昆虫的物种分化；抑制昆虫寄主植物的防御反应等等。

仁扇舟蛾(Clostera restitura)为鳞翅目(Lepidoptera)舟蛾科(Notodontidae )扇舟蛾属( Clostera),具有世代多、产卵量大.幼虫孵化率高、虫口数量易在短期内剧增等特点,是杨树重要的食叶害虫。国外分布于印度、越南、马来西亚和印度尼西亚,国内分布于南方的安徽、江苏、上海、浙江、江西、福建、湖南﹑广东、云南、海南﹑台湾和香港等地区。近些年,江苏、安徽、上海等地仁扇舟蛾相继爆发成灾,不仅影响了我国重要速生树种—杨树的生长发育,也造成很大程度的生态环境破坏。目前虽然开展了仁扇舟蛾的形态特征、生物学特性、与寄主植物的相互关系以及嗅觉感受蛋白等方面的研究,但未见其肠道共生微生物的研究报道。本期论文推荐的作者研究采用细菌分离培养法，利用 16S rDNA基因序列分析和 PCR扩增技术，结合菌落形态观察和生理生化特征来鉴定肠道中可培养细菌的种类，了解仁扇舟蛾肠道共生细菌的主要类群及其群落结构特征，为进一步研究特 异功能细菌的生理生化特征和功能奠定基础，也为探讨肠道菌群对宿主的生理功能和生态学意义提供理论依据。

下面跟学报君一探究竟！

作者简介

通讯作者

郝德君，男，南京林业大学林学院教授，博士生导师，主要从事森林昆虫学研究。

第一作者

朱晗，女，南京林业大学森林保护专业硕士研究生。

关键词：仁扇舟蛾；肠道细菌；可培养细菌；16S rDNA基因序列；群落结构

基金项目：江苏省高等学校大学生创新创业训练计划(201810298006Z);江苏省研究生科研与实践创新计划项目(SJKY19_0879)。

引文格式：朱晗，郝德君，魏原芝,等.仁扇舟蛾幼虫肠道可培养细菌群落结构分析[J].南京林业大学学报(自然科学版),2021,45(2):171-176.ZHUH,HAO DJ,WEI YZ, et al.Community stucture analyses of the intestine cultivable bacteria of Closteru restitura larvae[ J]. Journal of Nanjing Forestry University (Natural Sciences Edition) ,2021,45(2):171-176.DOI:10.12302/j.issn.1000-2006.201910011.

1目的

了解仁扇舟蛾(Clostera restitura)肠道共生细菌的主要类群及其群落结构特征,明确仁扇舟蛾幼虫前、中和后肠可培养细菌的种类及群落结构组成,为进一步研究特异功能细菌的生理生化特征和功能提供基础。

2方法

选取仁扇舟蛾5龄幼虫进行肠道解剖,分离前、中和后肠不同肠段,研磨稀释10⁻¹~10⁻⁶,分别涂布于NA和LB固体培养基上,每个处理重复3次,28℃培养72 h。后对前、中和后肠可培养细菌进行分离纯化培养,提取细菌基因组DNA,利用16S rDNA基因序列分析和PCR扩增技术,获得细菌基因组序列,后与NCBI GenBank数据库进行Blast同源性比对,参考序列相似度98%以上近缘序列的物种信息,结合菌落形态特征和生理生化特性鉴定细菌种类,利用MEGA 7.0软件,采用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统进化树。

2.1 试验材料

仁扇舟蛾2~3龄幼虫采自南京市浦口区乌江镇(118°52'E,31°89'N)杨树行道树,带回实验室后置于光暗周期为14L:10D,温度(25±2)℃ ,相对湿度为(65±5)%的条件下饲养,喂食新鲜的杨树叶片,每日更换1次。以实验室饲养的第2代5龄幼虫为供试昆虫。

2.2 研究方法

选取10头健康的5龄幼虫,饥饿处理12 h,后用PBS缓冲液冲洗虫体表面多次,置于75%酒精中体表消毒3 min ,并用无菌水漂洗3次。无菌环境下解剖肠道,将分离的前、中和后肠分别置于2mL离心管中,加入PBS缓冲液0.5mL研磨,并于室温下1 000 r/ min离心3 min,取上清液,用无菌水分别稀释10⁻¹~10⁻⁶倍,涂布于NA和LB固体培养基上。LB固体培养基(1L):蛋白券10 g,酵母浸膏5 g,NaCl 10 g,琼脂15g,pH 7.0。NA固体培养基(1L):蛋白券10 g,牛肉膏3 g，NaCl5 g,琼脂15g,pH 7.0。重复3次,置于28℃恒温培养箱中培养 72ｈ。根据菌落颜色、大小和形态分离纯化单菌落，纯化所得菌株于 25％甘油保存置于-80℃ 备用。

3结果

从仁扇舟蛾5龄幼虫的前、中和后肠中共分离获得2株可培养细菌,分属于变形菌门( Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria) ,共13个属,22个种。其中,假单胞菌属(Pseudomonas )4株;罗尔斯通菌属(Ralstonia)3株;芽孢杆菌属(Bacillus)3株;嗜麦芽寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)2株;气球菌属(Aerococcus)2株;其余微小杆菌属(Exiguobacterium)、微球菌属(Micrococcus)、短小杆菌属(Curtobacterium)、伯克氏菌属(Burkholderia)、类芽孢杆菌属( Paenibacillus)、节杆菌属( Arthrobacter)、短状杆菌属(Brachybacterium)和两面神菌属(Janibacter)各1株。细菌的种类存在差异,前、中和后肠不同肠段的细菌种类分别为510和7种。3个肠段共有的细菌种类是皮氏罗尔斯菌(Ralstonia picketti)和斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)。

3.1 肠道可培养细菌的形态特征

研究分离得到仁扇舟蛾5龄幼虫可培养细菌22株，其中前肠5株,中肠10株,后肠7株,对其依次编号为CF1一5、CM1一10和CH1一7。纯化后，22株菌的菌落和菌体形态的观察结果见表1。其中,3株菌的形状为球形,19株为杆状;8株细菌革兰氏染色呈阴性,14株细菌革兰氏染色呈阳性;9株细菌有芽胞,8株细菌有荚膜,18株细菌有鞭毛。

▼表 1 仁扇舟蛾幼虫肠道细菌基本特征

3.2 肠道可培养细菌的生理生化鉴定及16SrDNA基因片段的扩增与克隆

测定结果表明(表2),所有菌株对糖醇等碳素化合物的利用差异不显著,均具有较强的分解能力。但不同菌株在酶活测定、H₂S产生、硝酸盐还原、丙二酸盐及柠檬酸盐利用等方面具有显著差异,少数菌株在 IMViC实验中呈阳性反应。大多数菌株在大分子化合物水解实验中呈阳性反应,可分解利用淀粉、液化明胶、七叶苷、柠檬酸盐以及丙二酸盐,但不能还原硝酸盐且不能产生H₂S。

▼表 2 仁扇舟蛾幼虫肠道可培养细菌各菌株生理生化性状(部分)

注：“＋”表示阳性 ；“－”表示阴性.

以提取的肠道细菌基因组 DNA为模板,采用细菌通用引物(27F和1492R)扩增后,通过1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,条带清晰，且获得的细菌16SrDNA基因片段全长在1 500 bp左右,是实验所需目的片段(图1)。

▲图 1 肠道细菌 DNA PCR扩增电泳图谱

3.3 肠道可培养细菌的系统发育分析

将获得的序列提交NCBI GenBank 数据库进行Blast同源性比对,将测序得到的仁扇舟蛾幼虫肠道细菌16S rDNA序列进行系统进化分析,结果见图2。结合可培养细菌的形态特征和生理生化指标,鉴定结果如下:前肠5种细菌分别为:皮氏罗尔斯顿菌（Ralstoniapickeuti )、气球菌属( Aerococcus)、斯氏假单胞菌( Pseudomonasstutzeri)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)和Exiguobacterium acetylium;中肠10种细菌分别为:极小短小杆菌(Curtobacterium pusillum)、皮氏罗尔斯顿菌(R.pichettii)、唐莒蒲伯克霍尔德菌(Burkholderiaginsengis)、气球菌属(Aerococcus)、蜡状芽孢杆菌( Bacillus cereus )、苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophlia)斯氏假单胞菌(P. stutzeri)、荧光假单胞菌( Pscudomonas fluorescens)和Paenibacillus uliginis ;后肠7种细菌分别为:皮氏罗尔斯顿菌(R.pichettii)、钻特省芽孢杆菌(Bacillus drentensis)、斯氏假单胞菌(P.stutzeri)、节杆菌属(Arthrobacter)、短状杆菌属(Brachybacterium）、寡养单胞菌(S.rhizophlia)和瓜两面神菌(Janibacter melonis)。

▲图 2 仁扇舟蛾幼虫肠道细菌的 16S rDNA的系统发育进化树

4结论

仁扇舟蛾5龄幼虫肠道的可培养细菌种类较为丰富,其中以变形菌门和厚壁菌门为优势菌群。不同肠段中可培养细菌的多样性和群落结构存在差异,其中以中肠可培养细菌种类较为丰富。此次从仁扇舟蛾肠道中分离到与单宁降解相关的细菌,分析表明仁扇舟蛾肠道菌群与宿主的取食习性有关,肠道细菌可能在克服植物次生代谢物质的化学防御上发挥作用。

关注我们，更多精彩

,