芸香苷的提取分离和鉴定（代谢组联合分析揭示了紫茶花中苯类-苯丙烷色素和香气关系）

代谢物与表型最为接近！一方面，代谢物能反映生物体的真实生理状态，代谢物的变化直接导致表型的变化。相比于其他组学，代谢组受环境影响最大，环境对生物体的影响也是最终体现为代谢物的变化。但是单独代谢组检测，无法解释影响表型的基因机理，相反，转录组的表达不能直接证明表型是否发生变化。为了结合转录和代谢的优势，我们可以进行转录组 代谢组的联合分析，同时实现从“因”和“果”两个层面来探究生物学问题，相互间进行验证，从海量的数据中筛选出关键基因、代谢物及代谢通路，深度解析生物系统的宏观发育过程，解释生物过程的复杂性和整体性。

代谢物是植物表型（功能）的物质基础，园艺植物包括水果、蔬菜、花卉等，具有丰富的颜色性状和品质性状，这些性状和功能的物质基础是研究的热点方向。华南农业大学园艺学院张凌云老师团队近期在《Frontiers in plant science》上发表关于代谢组和转录组的联合分析，揭示了茶树BP型色泽与香气的关系，确定了花青素运输相关途径中的基因表达谱。

期刊：Frontiers in plant science

IF: 5.753

文章：Xin Mei, Shihua Wan et al., Integration of Metabolome and Transcriptome Reveals the Relationship of Benzenoid-Phenylpropanoid Pigment and Aroma in Purple Tea Flowers (2021).

日期：2021-11-23

DOI ：10.3389/fpls.2021.762330

合作单位：华南农业大学

研究背景

苯类化合物，尤其是苯丙烷，是植物颜色和香气的主要来源，它们帮助植物吸引传粉动物或阻止外敌侵害。类苯和类苯丙烷（BPs），例如类黄酮，是一组次级代谢产物，来源于莽草酸途径中的两种芳香族氨基酸苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸。

茶叶之所以成为一种受欢迎的非酒精饮料，其多样性和丰富的香气是两个原因。茶叶中的主要挥发性BPs为2-PE、Balc和MeSA，而AP和1-PE在茶花中是独特的。挥发性BPs和非挥发性BPs有一个共同的上游合成途径。它们都来源于苯丙氨酸，苯丙氨酸是由莽草酸途径产生的，苯丙氨酸分别进入苯丙氨酸代谢和合成途径。前者继续形成挥发性BPs，后者形成类黄酮，包括花青素。研究BP色素和香气的理想材料最好是含有尽可能多的花青素和挥发性BP。紫娟是一个特殊的茶树品种，有紫色的芽、茎和叶，但仍然缺乏AP和1-PE。此外，和其他茶叶品种一样，紫娟的花也是白色的，这意味着花青素的含量较低。然而在中国广东省白塘镇的茶园里找到了一份完美的材料，一种自然突变的品种（BT；C.sinensisvar.Baitang）有紫色的叶子和花。这个品种为研究BPs在茶树中的代谢以及BPs引起的色香味关系提供了更好的模型。

作者将茶花重新划分为三个阶段，即成熟花蕾（阶段1）、开花前（阶段2）和开花（阶段3）。此外，花香一般会在开花后大量释放，考虑到早期花青素的形成和香气的量，该研究选择了阶段2作为实验对象。

在这项研究中，为了研究挥发性和非挥发性BPs对紫色茶花的气味和颜色的作用，在白色（ZJ品种）和紫色（BT品种）茶花瓣中测定了BP型香气和花青素（图1），确定了生物合成和花青素运输相关途径中的基因表达谱，并分析了调节ZJ和BT之间气味和颜色变化可能的TFs。

图1 检测到白色和紫色茶花及其主要苯类-苯丙烷（BPs）的结构

实验材料与方法

实验材料：在广东省白塘镇的茶园中培育了紫茶花BT和白花茶花ZJ。采摘第2阶段（开花前）的花朵，收集花瓣液氮速冻，-80℃保存。

实验方法：百迈客转录组测序平台：Illumina HiSeq 2500，紫茶花BT和白花茶花ZJ各3各生物学重复。代谢组：GC-MS

主要结果与分析

挥发性苯类-苯丙烷类及相关基因分析

在白色和紫色茶花中，最丰富的挥发性苯化合物（BPs）是MeSA和AP、1-PE。在白色茶花中，MeSA是主要的挥发性BPs，相对于白色茶花，紫色茶花中的AP高出2倍。除MeSA外，其他常见挥发性BPs在紫色花朵中显著升高：1-PE、Bald和Balc分别为高出2,2.9,2.8倍；而在白花中没有检测到2-PE。总体上，紫茶花中的BPs发生了变化，其中苯丙烷类（AP、1-PE和2-PE）高于其他苯类（Bald、Balc和MeSA），而在正常的白色花朵中，则相反，这表明紫色茶花中苯丙烷类化合物的合成途径被促进。

然后，作者研究了四种直接合成苯甲酸苄酯、MeSA、2-PE和AP的基因，分别是苯甲醇邻苯甲酰转移酶（BPBT；KO id为K19861）、水杨酸羧基甲基转移酶（SAMT；KO id为K21483）、苯乙醛还原酶（PAR）和短链脱氢酶/还原酶（SDR）。他们都在紫色茶花中高表达。通过柱状图分析了两个品种之间存在显著差异的22个SDR基因成员。在紫色茶花中，22个SDR基因的总表达量高出1.3倍，其中表达水平最高的成员（TEA025281）也是如此。BPBT和PAR表达水平较低，分别为15和5倍。两个SAMT成员在茶花中高度诱导，在紫色花瓣中高出3-4倍。这些结果证明紫茶花中挥发性BPs的生物合成能力更强。

图2白色和紫色茶花中挥发性苯丙酸（BPs）及其相关基因的含量

非挥发性苯类-苯丙烷类及相关基因分析

在这两个品种的花瓣中共检测到20种花青素，其中5种花青素为苷元，分别为Pg、Cy、Dp、Pn和Pt。两种花色茶花中都有两到三种花色苷未检测到，即：白色茶花中的petunidin-3-O-(6’’-O-p-coumaroyl)glucoside-5-O-rhamnoside，cyanidin-3-O-(6’’-O-caffeoyl-2’’-O-xylosyl)glucosid和pelargonidin-3-O-glucoside

，以及紫色茶花中的cyanidin-3-O-(6’’-O-p-coumaroyl)rutinoside-5-O-glucoside 和cyanidin-3-O-caffeoylsophoroside（图3A）。这20种花青素的总含量紫色花瓣比白色花瓣高1.9倍。根据苷元类型，20种花色苷可分为2个Pg、11个Cy、1个Dp、2个Pn和4个Pt，其中Cy和Dp是主要的苷元（图3B）。

Dp只有一种糖苷形式，但它在紫色花瓣中含量丰富。紫色花瓣中的主要花色苷是delphinidin-3-O-glucoside，Cy-3-O-(6’’-O-p-coumaroyl)glucoside, Cy-O-syringic acid， Cy-3-O-glucoside和Cy-3-O-galactoside， 而在白色茶花中，则是 Cy-3,5-O-diglucoside， Pt-3-O-glucoside-O-arabinoside， Cy-3-O-(2’’-O-glucosyl)glucoside和 Cy-3-O-rutinoside 。除苷元外，这20种花青素中的另一半含有13种糖苷和1种丁香酸（图3C）。在白色花瓣中，花青素含量最高的是3,5-O-二葡萄糖苷，而在紫色花瓣中，3-O-葡萄糖苷含量极高。因此，两个茶树品种之间花青素的最大差异是DpG，这可能是紫色花呈紫色的主要原因，以及紫色花瓣中Dp和葡萄糖的生物合成可能已增强。

为了研究花青素生物合成过程，作者对ZJ和BT两个品种的花瓣进行了转录组测序。类黄酮生物合成途径表达谱分析发现每个基因都有多个成员，其中一些在白色花瓣中较高，而另一些则相反（图4）。然而，根据每个基因中存在显著差异的成员的表达总和，发现紫色花瓣中的大多数基因表达下调，尤其是C4H、FLS、LAR和ANR，表达显著降低，但F3’H和F3’5’H明显上调，特别是F3’5’H被提高了8倍，这证明了它在产生Dp中的关键作用。此外，由于ANR的含量很低，Dp不能还原为表儿茶素，因此不能被用于合成DpG，而DpG是由bronze-1（BZ1）催化的。BZ1是一种花青素3-O-葡萄糖基转移酶，也称为UFGT。BZ1基因成员在紫色花瓣中的总表达水平是白色花瓣的3倍。

为了进一步揭示两个茶树品种之间BPs的不同合成机制，检测了上游化合物和基因（图5）。在紫色花瓣中，3-磷酸甘油醛（GA3P）增加了2.9倍，而磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）仅为白色花瓣的38%，这表明紫色花瓣中的碳代谢被促进，但它可能不会进入苯丙氨酸的下游代谢。PEP的降低可能是由于高度诱导的3-脱氧-D-阿拉伯庚糖酸7-磷酸合成酶（DAHPS）所致。在紫色花瓣中，DAHPS基因的主要成员TEA028537的表达量高出4.6倍。芳醇脱水酶/预苯酸脱水酶（ADT）催化芳醇生成苯丙氨酸。它的主要成员TEA033282在紫色花瓣中略微升高，高出1.3倍。此外，合成的花青素在显示颜色之前需要运输到液泡中，该过程与谷胱甘肽S-转移酶（GST）、多药耐药相关蛋白（MRP）以及多药和毒素挤压（MATE）有关。把这些显著差异基因的表达量加起来，发现紫色花瓣的总表达量都较高，分别高出1.1， 1. 3和1.7倍。紫色花瓣中这三个基因的主要成员（TEA015341、TEA001531和TEA006958），表达量分别高出6.9, 1. 4，和3.9倍。

图3 非挥发性BPs在白色和紫色茶花之间的差异（p<0.05）。（A） 所有花青素的峰面积；（B）同一苷元的聚集；（C）相同糖基的聚集

图4花青素生物合成相关基因的表达水平

图5 BPs上游生物合成途径中的关键化合物和基因，以及与花青素运输相关的基因在白色和紫色之间的表达量差异

参与苯类-苯丙烷生物合成的转录因子

上述结果表明，在紫色花朵中，最具特征的挥发性和非挥发性BPs分别为AP和DpG。计算了Ps和TFs之间的皮尔逊相关系数，发现这两个茶叶品种之间存在显著差异。AP和DpG的14个TF的相关系数大于0.95（表1）。他们属于AP2/ERF、bZIP、EMP、GATA、HS、MYB、NAC、TCP和WRKY家族，在紫色花种分别高出1.6–6.7倍，其中MYB、AP2/ERF、bZIP、TCP和GATA的表达水平最高。

作者分析了14个TFs与上述结构基因之间的相关性，以发现潜在的调节机制（图6）。大多数TFs与PAR、SAMT和SDR高度相关，这有助于挥发性BPS合成；以及4CL、BZ1、CHS、F30H、F3050H、FLS和LAR，它们有助于非挥发性BPs合成；以及ADT和DAHP在苯丙氨酸上游生物合成中起作用。相比之下，这些TFs并不关注花色素苷运输的特定基因。

图6转录因子（TFs）和结构基因之间的相关性

表1 候选转录因子（TFs）参与苯乙酮（AP）和delphinidin-3-O-葡萄糖苷（DpG）的生物合成

总 结

研究发现在BT紫色花瓣中，BP型香气随着BP型颜色的出现而增加。AP和DpG大量累积，是主要的挥发性和非挥发性BPs，此外莽草酸途径中的结构基因和挥发性BPs的合成得到了促进。类黄酮合成途径的大多数基因被下调，并且流出被引导积累Dp。许多TF参与调节紫色及其相关香气。该研究结果揭示了茶树BP型色泽与香气的关系，为了进一步阐明调控机制，未来需要对相关基因的功能进行更多的鉴定。

图8 紫色与白色茶花中BPs合成相关基因的表达谱比较；绿色和红色箭头分别表示紫色花瓣中较低和较高的部分

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