圆褐固氮菌的分离和鉴定（猪源高产蛋白酶芽胞杆菌的分离与鉴定）

蛋白酶广泛存在于人和动物的消化道中，对蛋白质的消化吸收起着至关重要的作用。猪饲料日粮中蛋白质的含量一般为13％～17％，蛋白质能被消化降解多少将直接影响着动物的生产性能和经济效益，而蛋白质必需经过蛋白酶降解成短肽或氨基酸后才能被动物利用。一般成年猪能够分泌足够的蛋白酶消化蛋白质，但仔猪消化机能尚未发育完全，蛋白酶分泌量不足，在一定程度上影响了其生长速度，所以在仔猪日粮中添加外源蛋白酶不但能补充体内内源酶的不足，而且能激活内源酶的分泌，将蛋白质分解成多肽、寡肽或氨基酸等，因而有利于仔猪对蛋白质的消化分解和吸收利用。

目前虽然已开发出多种蛋白酶制剂，但由于菌种酶活力低、生产成本高，因而有关蛋白酶饲料营养方面有待进一步研究。本实验从不同地区来源的猪粪样品中分离产蛋白酶芽孢杆菌，旨在筛选高产蛋白酶菌株，同时也筛选适合作为饲料添加剂的产蛋白酶芽孢杆菌，为临床上提供产酶益生菌奠定基础。

一、材料

1 、样品 分别从河南省各地区采集猪粪便等样品80份。

2、 培养基 (1) 分离培养基：酪蛋白0.5％／脱脂奶粉0.5％，酵母膏0.2％，琼脂2％，调pH7.5。(2) 发酵培养基：牛肉膏0.5％，氯化钠0.5％，蛋白胨0.5％，琼脂1.5％，调pH7.5。

3 、主要试剂 (1) 微量生化发酵管：葡萄糖、蔗糖等36种发酵管购自杭州天和微生物试剂有限公司；(2) PCR试剂：Taq酶(5U/μl)、DL2000、Goodview、琼脂糖凝胶：购自北京方宝生物科技有限公司；(3) 引物：参考芽孢杆菌的16S rDNA序列设计一对引物，由上海生物工程有限公司合成。P1：5’-CTGCAGCTA CCGGTCGCCACCATG-3’，P2：5’-GAATTCTTAC TTGTACAGCTCGTCCATG-3’。

二、方法

1 、样品采集及处理 分别从河南省各地区采集猪粪便80份样品装入样品袋内，4℃保存备用。取样品约lg加入10ml无菌水中，制成10％的混悬液， 80℃水浴热处理30min。

2、 产蛋白酶菌株初筛、纯化 将处理过的上清稀释到一定浓度，取200μl涂布于分离培养基，置37℃培养24h，挑选能产生酶解圈的菌落，革兰氏染色，显微镜镜检初步认为是芽孢杆菌的，再进行纯化培养。

3 、复筛 取菌液2μl纯化的菌液在分离培养基上滴种，置于37℃恒温培养24h，观察并测量各菌株酶解圈和菌落直径，通过比较其比值大小，初步筛选出高产蛋白酶菌株。

4 、蛋白酶活力测定 采用福林酚(Folin)法测定酶的比活力，蛋白酶酶活单位的定义：在一定温度和pH条件下，lmin水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单(U)。

5 、菌株的生化试验 将上述筛选的菌株接种到微量发酵管，37℃恒温培养12h，观察并记录实验结果，以标准枯草芽孢杆菌(B.subtilis ATCC6633)为对照。

6 、16S rDNA的鉴定 根据文献[4]方法提取芽孢杆菌杆因组，并以此为模板，反应体系如下：10×PCR buffer 5μl，MgCl2 2.5μl，dNTP（10mM）2μl，上游引物（10mM）2μl，下游引物（10mM）2μl，Taq DNA 聚合酶（5U/μl）0.5μl，模板DNA 1μl，ddH2O 38μl。反应参数：94℃，3min→（94℃，50sec→55℃，90sec→72℃，90sec，30 cycles）→72℃，10min→4℃。取5μl PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳观察结果。

7、 序列分析 将上述PCR产物送至中美泰和生物技术（北京）有限公司测序，然后将所测序列提交到NCBI网站（美国国立生物技术中心网站）进行blast同源性分析。

三、结果

1、菌株初筛结果

通过菌株的菌落特征、显微特征和酶解圈的大小，初步分离得到86株产蛋白酶的菌株

2、 复筛

通过在分离培养基上滴种，比较酶解圈直径与菌落直径的比值大小，初步筛选出高产菌株，

3 、菌株生理生化鉴定

B.A464能氧化利用β-半乳糖苷、阿拉伯糖、甘露糖等，不能利用山梨糖、淀粉、葡萄糖酸盐等，根据形态特征观察及生理生化鉴定结果，参照伯杰氏细菌鉴定手册和常见细菌系统鉴定手册该菌株基本符合蜡样芽孢杆菌的主要特征。因此初步鉴定B.A464为蜡样芽孢杆菌。

4、 16S rDNA鉴定结果

4.1 PCR扩增结果

PCR扩增结果表明，该菌株的16S rDNA序列大小约为1500bp，与预期大小一致，

4.2 序列测定和序列进化树分析结果

经测序得16S rDNA序列长度为1463bp，与预期结果一致。将上述序列提交到美国国立生物信息中心(NCBI)进行Blast，结果见图3，由图可知菌株B.A464与蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus(B.cereus)亲缘关系最近，同源性比对结果表明该株菌与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus 08001)的同源性为99％。

四、讨论一下

蛋白酶能作用于饲料中的主要成分蛋白的一种酶制剂，它在一定程度上可以帮助动物消化、降解饲料中的高分子蛋白质，对提高生产性能将起很大的作用，尤其是在幼龄动物上应用效果更为明显，已在仔猪、雏鸡等的生产性能上取得了良好的效果。

作者：李三栋