血清脂联素与脑梗死国际研究背景（穴位注射葛根素对布比卡因中毒大鼠心肌线粒体能量代谢的影响及其机制研究）

本文引用：于妍, 王春爱, 秦晓宇, 李玉兰, 梁曦, 温晓辉, 刘敏. 穴位注射葛根素对布比卡因中毒大鼠心肌线粒体能量代谢的影响及其机制研究[J]. 中国全科医学, 2022, 25(18): 2280-2285. DOI: 10.12114/j.issn.1007-9572.2021.02.143

Yan YU, Chunai WANG, Xiaoyu QIN, Yulan LI, Xi LIANG, Xiaohui WEN, Min LIU. Effect and Mechanism of Action of Acupoint Injection of Puerarin on Myocardial Mitochondria Energy Metabolism in Bupivacaine-poisoned Rats[J]. Chinese General Practice, 2022, 25(18): 2280-2285. DOI: 10.12114/j.issn.1007-9572.2021.02.143

穴位注射是在传统针灸基础上发展起来的一种疗效显著的中西医结合疗法，其以经络学说为指导，将腧穴、经络、药效有机结合，兼具针刺和药物的治疗作用，具有用药剂量小、不良反应少的特点，还能大幅度提升临床疗效。近年来穴位注射方法在辅助麻醉及心律失常治疗领域上广泛应用[1,2]。

布比卡因是一种长效的酰胺类局麻药，因其常规剂量下使用相对安全，且起效快速，常被用于各类手术[3]。然而，过量使用或误入静脉仍会导致心律失常、心肌收缩力降低以及循环衰竭从而引发心脏骤停[4]。临床常用针刺辅助麻醉以减少布比卡因所需剂量，从而避免其不良反应[5]。内关穴是治疗心血管疾病的常用穴位之一，刺激内关穴具有抗心律失常、减轻心肌损伤的作用[6]。大量研究表明葛根素具有明显的心脏保护作用[7]。本研究旨在探讨穴位注射葛根素对布比卡因诱导的心肌线粒体结构和功能损伤的影响及其可能的机制。

6月龄SPF级Wistar雄性大鼠40只，体质量（280±20）g，由兰州兽医研究所实验动物中心提供（SCXK[甘]2019-0002）。本实验遵循美国国家卫生研究院《实验动物使用指南》，并经甘肃省中医院伦理委员会批准（批件号2019-005）。实验时间为2019年1—12月。

盐酸布比卡因注射液购自上海朝辉药业有限责任公司（批号：1404113），葛根素注射液购自成都天台山制药有限公司（批号：180201），JC-1试剂盒购自Beyotime公司，大鼠三磷酸腺苷合成酶（ATPase）酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒购自Elab Science公司，三磷酸腺苷（ATP）ELISA试剂盒、Anti-过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）购自Abcam公司，Anti-核呼吸因子（NRF1）、Anti-线粒体转录因子A（mtTFA）购自GeneTex公司。

鼠控温解剖台（众实迪创科技发展有限公司），微量注射泵（圣诺医疗设备有限责任公司，SN-50F6），多道电生理记录仪（AD instruments，DBS-170），Power Lab数据采集及分析系统（埃德仪器国际贸易公司），精密电子天平（Sartorius公司），高速冷冻离心机（Sigma公司），-80 ℃超低温冰箱（Form scientific公司），酶联免疫检测仪（Thermo公司）。

采取随机数字表法将实验动物分为空白组（C组）、模型组（B组）、治疗组（T组）、预防组（P组），每组10只。P组：双侧内关穴分别注入0.1 ml的葛根素注射液。5 min后开始建立布比卡因中毒模型（C组除外），建模方法参照文献[8,9]，经10%水合三氯乙醛麻醉后，经股静脉2 min内静脉滴注0.5%布比卡因10 mg/kg，Ⅱ导联心电图出现心律失常（频发室性期前收缩、室性心动过速、QRS延长20%）表明模型建立成功。将1根套管针置于右侧颈动脉以采集血样及监测动脉血压，将另1根套管针置于左侧股静脉以术中给药，并链接PowerLab系统；术中持续监测大鼠外周血压及Ⅱ导联心电图。

C组不建模，于双侧内关穴（大鼠前肢内侧，离腕关节约3 mm尺桡骨缝间）分别注入0.1 ml 0.9%氯化钠溶液。B组：建模成功后即刻取双侧内关穴分别注入0.1 ml 0.9%氯化钠溶液。T组：建模成功后即刻取双侧内关穴分别注入0.1 ml葛根素注射液。C组在静脉滴注0.9%氯化钠溶液的第8分钟，B组、T组、P组分别在静脉滴注利多卡因的第8分钟处死大鼠，提取所有大鼠左室心肌，分离心肌细胞线粒体。

实验结束后对大鼠实施安乐死，并逆行灌注，提取左室心肌，-80 ℃保存。心肌细胞匀浆，冷冻高速离心，2 000 r/min离心10 min（离心半径5 cm）。取上清液，10 000 r/min离心15 min（离心半径5 cm），分离心肌细胞线粒体，采用透射电镜观察线粒体的结构。

采用Flameng评分法评价线粒体半定量结构，每个电镜标本随机选择若干个视野，对每个视野中的线粒体按此法将线粒体的改变分为5级，并按等级记分；0级（0分）：正常超微结构的线粒体，颗粒完整；Ⅰ级（1分）：结构基本正常，部分颗粒丢失；Ⅱ级（2分）：线粒体肿胀，基质透明；Ⅲ级（3分）：基质透明，线粒体嵴断裂或基质中出现絮状凝集；Ⅳ级（4分）：基质丢失，线粒体嵴断裂，外膜不完整。

采用ELISA法检测心肌细胞ATPase活性。组织样品在磷酸盐缓冲液中匀浆后，离心获得上清液，37 ℃孵育30 min，用酶标记剂冲洗、孵育、显色。反应结束后，测量各孔的吸光度，并记录。

采用磷钼酸比色法测定线粒体ATP含量。将心肌组织裂解，4 ℃下12 000×g离心5 min，收集上清液，用分光光度计对样品进行检测。

采用JC-1试剂盒测量线粒体膜电位（MMP）。将1×JC-1工作液按适当比例加入纯化的线粒体中，激发波长为458 nm，发射波长为590 nm，用荧光分光光度计对样品进行检测。

心肌组织样品匀浆后取上清液，分离蛋白，测定总蛋白浓度，蛋白样品经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，而后将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，用一抗、二抗在37 ℃下分别孵育1 h，用增强化学发光法获得Western blotting图像。采用Image J软件对靶蛋白条带进行灰度分析，记录PGC-1α、NRF1、mtTFA蛋白水平。

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以（

±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

C组大鼠心肌细胞线粒体数量丰富，颗粒完好呈卵圆形，包膜完整，嵴连续；B组大鼠心肌细胞线粒体数量减少、分布不匀，部分线粒体体积变小、形态改变、线粒体膜完整性被破坏，少量线粒体嵴断裂缺失；T组大鼠心肌细胞线粒体数量略减少，个别线粒体变形、线粒体嵴断裂缺失；P组大鼠心肌细胞线粒体数量较丰富，颗粒完整，部分线粒体嵴紊乱，无断裂缺失（图1）。

四组大鼠Flameng评分法得分比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其中B组、T组、P组大鼠Flameng评分法得分高于C组，差异有统计学意义（P<0.05）；P组大鼠Flameng评分法得分低于B组、T组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

四组大鼠ATPase活性、ATP含量、MMP比较，差异有统计学意义（P<0.05）。

B组、T组大鼠ATPase活性低于C组、P组，差异有统计学意义（P<0.05）。B组、T组、P组大鼠ATP含量、MMP低于C组，差异有统计学意义（P<0.05）；T组、P组大鼠ATP含量、MMP高于B组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

四组大鼠PGC-1α、NRF1、mtTFA蛋白水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）。B组、T组、P组大鼠PGC-1α、NRF1、mtTFA蛋白水平低于C组，差异有统计学意义（P<0.05）；T组、P组大鼠PGC-1α蛋白水平高于B组，差异有统计学意义（P<0.05）；P组大鼠NRF1蛋白水平高于B组、T组，差异有统计学意义（P<0.05）；T组、P组大鼠mtTFA蛋白水平高于B组，差异有统计学意义（P<0.05）；P组大鼠mtTFA蛋白水平高于T组，差异有统计学意义（P<0.05），见表3、图2。

布比卡因是临床工作中广泛使用的麻醉药物，但其具有严重的心脏毒性。目前，应用最多的解毒方法是使用脂肪乳剂，但同时也存在许多争议。因此，寻找一种更加安全、有效的救治布比卡因心脏毒性的方法具有重要意义。针灸因其简便易行、价廉、安全等诸多特点在麻醉领域的应用越来越受到重视，但对于针灸对抗麻醉药心肌毒性方面的研究还处于起步阶段。本课题组前期实验结果表明穴位处理为治疗布比卡因所引起的心脏毒性提供了一定理论依据[9]，但其具体的作用机制还有待进一步研究。近年对于布比卡因心肌毒性的研究主要集中在对线粒体损伤及能量代谢障碍方面，本研究将利用现代分子生物学实验技术，从亚细胞器水平出发，全面探讨穴位预处理对抗布比卡因中毒大鼠心肌线粒体损伤及能量代谢障碍的作用靶点及分子机制，为其临床应用提供科学依据，为中医药防治布比卡因心肌毒性的研究提供新思路。

线粒体通过电子传递和氧化磷酸化为真核细胞提供能量[10]，若以上过程发生障碍，则会引起细胞内ATP产量减少。ATP产生一旦减少，呼吸链电子漏出的活性氧（ROS）随即增加，导致MMP降低、通透性转换孔（MPTP）开放，线粒体内外膜的通透性与完整性发生变化，进而影响其形态结构，形态结构改变后又会加重线粒体的功能异常，形成恶性损伤循环[11]。有研究显示，布比卡因引起心脏毒性的机制之一是其损伤心肌细胞线粒体的结构和功能。布比卡因可使线粒体的体积增大、数量减少[12]，呈空泡或髓样改变[13]；还可降低部分线粒体呼吸链复合体的活性，导致电子传递障碍，影响线粒体能量代谢、产能减少[14,15]，促进线粒体中ROS的产生[16]，但具体的调节机制尚不明确。

PGC-1α是线粒体能量代谢的关键因子[17,18,19]，PGC-1α与NRF1结合后，激活mtTFA活性，控制线粒体DNA（mtDNA）的复制与转录，调控ATPase等线粒体基因组编码呼吸链亚基的表达。本实验结果显示，B组、T组大鼠ATPase活性低于C组，B组、T组、P组大鼠ATP含量、MMP及PGC-1α、NRF1、mtTFA蛋白水平低于C组，表明布比卡因可抑制PGC-1α、NRF1、mtTFA蛋白的表达，降低ATPase活性，减少ATP合成，使线粒体MMP下降，导致线粒体的结构损害，产生心肌毒性。

既往研究表明，内关穴的心肌保护作用主要通过调节线粒体能量代谢的各种信号来实现[20]。从中药葛根中分离的葛根素通过靶向作用线粒体亦显示出对心肌的保护作用[21]。本课题组前期实验结果表明，内关穴注射葛根素减轻布比卡因导致大鼠心脏毒性的机制与其增加心肌组织中的乳酸脱氢酶（LDH）活性、增加Na -K -ATPase活性、调节线粒体能量代谢有关[22]。本研究结果显示，P组大鼠ATPase活性高于B组、T组，T组、P组大鼠ATP含量、MMP高于C组；T组、P组大鼠PGC-1α蛋白水平高于B组，P组大鼠NRF1蛋白水平高于B组、T组，T组、P组大鼠mtTFA蛋白水平高于B组，P组大鼠mtTFA蛋白水平高于T组；表明通过穴位注射葛根素可以逆转布比卡因造成的线粒体结构及功能损伤，保护心肌细胞，且注入布比卡因前预先穴位注射葛根素对线粒体的调节作用明显优于注入布比卡因出现心律失常后再穴位注射葛根素。但因本实验未设立相关蛋白分子的激动剂和抑制剂组，所以难以得出因果关系，这也是今后本课题组进一步研究的方向。

综上所述，穴位注射葛根素可减轻布比卡因致心肌线粒体损伤，可能与其调节PGC-1α/NRF1/mtTFA信号转导通路、保护线粒体能量代谢、减轻线粒体结构损伤有关，具体调节机制尚待进一步研究。

本文无利益冲突。

本文部分图表略

参考文献略

穴位注射葛根素对布比卡因中毒大鼠心肌线粒体能量代谢的影响及其机制研究