乌龟是如何分辨男和女（浙江万里学院青年教师破解半个世纪的谜团）

BioArt按：性别决定长久以来都是生物学中的一个重要问题。在高等脊椎动物中，性别一般由基因来决定，而在许多爬行动物或鱼类中，性别决定往往受到环境（温度、激素、pH值）的影响，大部分龟类动物中都存在温度依赖型性别决定（简称为“TSD”）的现象。自1966年法国学者Madeleine Charnier（1919-2002）发现TSD现象以来，此后在长达半个多世纪的时间里，学界一直没有弄清楚TSD背后的关键分子机理。来自浙江万里学院的研究团队多年来一直致力于研究乌龟的TSD机理，在前期发表的系列重要成果的基础上，该团队取得了突破性进展，证明了“组蛋白去甲基化酶KDM6B调控了龟的温度依赖型性别决定”，相关成果发表到了Science杂志上，并得到了Science配发的评论文章的高度评价，认为“该工作解开了TSD研究长达半个世纪的谜团”。有鉴于此，BioArt特别邀请了著名的表观遗传学家、中科院生物物理所朱冰研究员以及复旦大学蓝斐教授对上述工作进行点评，以飨读者。

Science论文中的研究对象红耳龟（Trachemys scripta），俗称“巴西龟”。 图片来源：http://www.reptilesofaz.org/Turtle-Amphibs-Subpages/h-t-scripta.html

按照性别决定成因来看，性别决定模式一般分为 基 因 型 性 别 决 定(genetic sex determination, GSD)和环 境 依 赖 型 性 别 决 定(environmental sex determination, ESD)两大类。而温度依赖型性别决定 (temperature-dependent sex determination,TSD)是 ESD 中最典型的性别决定模式，其最主要特点是缺少性染色体、胚胎孵化的温度决定子代性别，该模式常见于爬行动物（如红耳龟）【1-5】。红耳龟在较低的孵化温度(26℃)产生 100%的雄性子代, 较高的温度(32℃)则产生全雌子代, 是 TSD 机制研究的一个理想动物模型。

1966年，法国动物学家Madeleine Charnier最早在彩虹飞蜥（Agama agama）上描述了温度依赖型性别决定（以下简称“TSD”）现象【2】。这一结果仅发表到了一个发行量非常有限的会议杂志上，而Charnier的成果多年也都没有得到认可【6】。

彩虹飞蜥（Agama agama）

TSD现在发现以后，学界对之进行了长达半世纪的研究，但其分子机理仍是未解之谜。TSD机制的解析主要要解答两个科学问题：①哪个（些）基因负责启动未分化性腺向睾丸或卵巢分化?②温度如何调控这些基因的表达？上世纪90年代后期，学者们陆续发现Dmrt1、Sox9、Amh等遗传型性别决定（genetic sex determination, GSD）关键基因在TSD动物中同样存在，并且在性腺分化之前呈现雌雄差异性表达【7-9】。

2016-2017年，来自浙江万里学院的钱国英、葛楚天团队等先后在《中国科学：生命科学》和Development杂志上发表文章，通过基因功能鉴定进一步证实Dmrt1是启动红耳龟雄性性腺分化的关键基因【10,11】。因此，目前破译TSD机理的关键问题就变成：温度通过何种机制来激活或抑制这些基因的表达？

北京时间5月11日凌晨2点，浙江万里学院葛楚天、钱国英团队等在Science杂志上发表了题为 The histone demethylase KDM6B regulates temperature-dependent sex determination in a turtle species 的研究论文，在爬行动物温度依赖型性别决定研究领域取得重要进展，揭示了组蛋白去甲基化酶KDM6B调控红耳龟温度依赖型性别决定的分子机理，解开了温度依赖型性别决定研究长达半个世纪的谜团，是近期国内原创性成果的代表之作。

最近几年，很多有趣的生物学现象都从表观遗传的角度找到了部分答案，其中最典型的就是“获得性遗传”，这一理论将环境因素和基因表达紧密联系到了一起【12-14】。一般来讲，TSD动物雌雄个体基因组DNA序列完全一致，性别性状却差异显著，因此研究人员推测表观遗传很可能参与调控TSD。

已有研究发现，Cyp19a1、Sox9等性别分化关键基因的DNA甲基化或组蛋白修饰水平，在一些TSD物种的雌雄性腺中存在差异【15-19】。但是，这些研究还局限于关联性分析，无法解释这些表观遗传标记的差异是性腺分化的诱因还是结果。换言之，“表观遗传机制调控TSD”假说尚缺乏直接的遗传证据。

此前，Czerwinski等通过红耳龟RNA-seq数据，分析了一些典型的表观遗传因子在红耳龟早期雌雄性腺中的表达差异，发现Kdm6b（H3K27去甲基化酶）的表达量在产雄温度（male- producing temperature, MPT）下显著高于产雌温度（female-producing temperature, FPT）【20】。此外，Yatsu等在美国短吻鳄转录组中的数据显示，与红耳龟一样，Kmd6b在低温胚胎性腺中的表达量明显上调；并且在温度置换中，Kdm6b表达量发生了快速的变化【21】。研究人员基于这些数据推测，Kdm6b很可能参与调控TSD，并且这种调控作用可能具有爬行动物普遍性意义。因此，研究Kdm6b在TSD中的生物学功能及其调控机制，提供表观遗传调控TSD的直接证据，对TSD机理的破译具有重要的科学意义。

钱国英、葛楚天教授团队发现，KDM6B在红耳龟未分化性腺中呈现温度依赖型二态性表达分布。温度置换实验表明，在性腺分化前，Kdm6b能快速响应温度变化。令人惊奇的是，通过RNA干扰将产雄温度（MPT）胚胎Kdm6b敲低后，80-87%的MPT胚胎出现雄性向雌性性逆转。

通过ChIP-seq/qPCR和回复实验（rescue experiment）对Kdm6b下游靶基因进行筛选和功能鉴定，进一步分析发现，KDM6B通过消除启动子区H3K27me3标记，直接促进红耳龟雄性性别决定基因Dmrt1的表达。并且，Dmrt1的过表达能够恢复由Kdm6b缺陷引起的性逆转。

总的来说，该项研究阐明了Kdm6b在红耳龟TSD中的生物学功能及其作用机制，为“表观遗传机制调控TSD”假说提供了首个直接的遗传证据，继而为最终全面破译TSD机制奠定基础。而下一步要解决的极具挑战的关键科学问题可能就是要研究表观因子KDM6B是如何受温度调控的。

值得一提的是，Science杂志配发了题为How does temperature detemine sex? 的评论文章，对上述工作给予了极高的评价，称“该工作解开了TSD研究长达半个世纪的谜团”（Temperature responsive epigenetic regulation clarifies 50 year-old mystery）。

编者的话：

龟类动物是研究TSD机制的一个非常好的系统，但是研究深度远不如模式生物，主要原因是缺乏有效的基因操作/编辑技术。虽然当前CRISPR/Cas9基因编辑系统正如火如荼地应用于各种生物，但用于龟类动物还有很大的技术难度。当前，研究人员主要使用的技术是基于慢病毒介导的RNA干扰或过表达系统。据悉，浙江万里学院的钱国英、葛楚天团队近几年利用该系统，已能够很好的在红耳龟和中华鳖中进行相关实验，发现目标基因在胚胎内能长期（50天以上）被敲低或过表达【11,12】，这些技术问题的解决为后续工作奠定了坚实的基础。另据了解，该工作前后研究长达5年，主要工作全部在国内完成。

葛楚天教授团队成员合影。左起：蔡城，张瑜，葛楚天，孙伟，周英杰

浙江万里学院的葛楚天教授为该论文的第一作者兼通讯作者，杭州市水产技术推广总站的叶键高级工程师为并列第一作者，浙江万里学院的钱国英教授和杜克大学的Blanche Capel教授为共同通讯作者。

专家点评

朱冰（中科院生物物理所研究员，国家“杰青”）

Comments：有性繁殖是生物多样性和物种进化的源泉，性别决定毫无疑问是个有趣的生物学现象。许多物种，包括我们人类存在性染色体，并通过个体的性染色体组成来决定其性别。然而，在某些爬行动物中，性别决定受到温度的调节，例如本文的研究对象巴西红耳龟（Trachemys scripta）。巴西红耳龟在26℃时胚胎发育成雄性，在32℃时胚胎则发育成雌性，其响应温度信号的机制不明。

作者利用转录组分析，发现组蛋白H3K27me3去甲基化酶KDM6B在性腺中的表达水平受到温度调节，在26℃时大量表达，但在32℃时则表达大大下降。通过RNAi干扰敲低KDM6B，作者发现即便在26℃时多数胚胎也发育成雌性，表明KDM6B的确在温度对性别决定的过程中起了重要作用。此后，作者通过对KDM6B敲低后性腺转录组的分析，发现在性别决定中起着重要作用的转录因子Dmrt1的表达受KDM6B调控，并通过ChIP实验证明Dmrt1是KDM6B的直接靶基因。作者进一步发现过表达Dmrt1能够逆转KDM6B敲低导致的性别变化，为本文的研究画上了一个完美的句号。

这首先是一项非常有趣的研究工作。我阅读本文时最欣赏的是这一工作清晰的研究逻辑性。作者从组学分析寻找候选基因开始，通过候选基因的表型验证、候选基因的作用靶点探究、以及作用靶点与候选基因间的遗传互作。一层一层抽丝剥茧，发现并详尽地证明了KDM6B在响应温度变化、参与性别决定过程中的重要作用。

最后，我想说这是又一个表观遗传因子（KDM6B）与序列专一性转录因子（DMRT1）协调作用，共同参与细胞命运决定的重要例证。

蓝斐（复旦大学生物医学研究院教授，国家“青年千人”）

Comments：KDM6去甲基化酶家族对于H3K27甲基化的催化活性是在2007年时被报导的，说明了与发育密切相关的H3K27me3修饰是动态可逆的，这在当时也引起了一定的轰动。但尽管备受关注，由KDM6家族参与调控的明确生物学表型至今还十分有限。

而这项在红耳龟的温度—性别决定的研究中，作者发现了KDM6B在较低温度（26摄氏度）时的特异性表达，对于激活雄性性别决定至关重要。当KDM6B缺失时，原本该发育成雄性的红耳龟80%多都启动了雌性发育程式。这项研究意义重大，不仅阐明了组蛋白H3K27甲基化的动态调控对于爬行类性别决定的分子机理，还为环境因素通过表观遗传通路控制基因组的表型提供了一个重要证据。当然，人类的性别决定在极大程度上是不受环境控制的，但也有关于极端生存环境可能影响到人群的性别比例的报道，是否有平行的表观机制参与？这将是一个十分有意义的研究方向。

参考文献：

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葛楚天教授简介：

葛楚天，1983年生，博士，浙江万里学院教授，硕士生导师。浙江省高校中青年学科带头人，浙江省151人才工程第三层次，宁波市领军和拔尖人才第二层次。从事水生动物发育和生殖生物学研究，主要研究方向：(1)水生动物性别决定和性腺分化的分子机制;(2)温度依赖型性别决定分子基础；（3）水产动物性别控制和单性育种。主持国家自然科学基金、科技部星火计划、浙江省自然科学基金、浙江省科技厅项目等5项国家级省部级项目。获农业部农牧渔业丰收奖一等奖（排2）和浙江省科学技术奖二等奖（排2）各1项。在Science、Development、 Endocrinology、Biol Reprod等学术期刊上发表论文20余篇，其中SCI收录12篇。获得国家发明专利2项。主要学术兼职：美国动物学会会员（2007-）；美国发育生物学会会员（2017-）；《Dev Biol》、《PLoS ONE》等SCI杂志审稿人。

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