作物实验项目简介（巴厘菠萝组织培养技术）

基金项目：巴厘菠萝组织培养技术

基金项目：海南省自然科学基金面上项目 “菠萝组织培养过程中体细胞无性系变异的研究”(No.317244)；海南省自然科学基金面上项目 “不同菠萝品种对乙烯诱导成花敏感性差异的分子机理研究”(No.20163108)。

1 ‘巴厘’菠萝组织培养技术

1.1 取材及消毒

1.1.1 取材

供试材料为生长健壮、无病虫害的 ‘巴厘’品种的吸芽或腋芽，采自中国热带农业科学院南亚热带作物研究所种质资源圃。

1.1.2 消毒

在晴天采下生长健壮的吸芽或腋芽，从基部剥除衰老叶片后，用自来水将芽冲洗干净，在吸芽生长点上方约5 cm处切断所有叶片，将芽和着生在吸芽上的白色叶基放入2%NaClO消毒10 min，无菌水冲洗3次，再放入0.1%HgCl消毒8 min，无菌水冲洗3次。

1.2 组织培养

1.2.1 直接再生途径

用灭好菌的手术刀，将消毒好的外植体纵切成2～3块，接种于MS＋2.0 mg/L 6-BA＋2.5 mg/L NAA的固体培养基上进行启动培养，培养20～30 d后，从叶腋处萌发出不定芽。将不定芽从基部切下，转接于MS＋2.0 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L NAA培养基上进行继代增殖，继代周期为25～30 d，增殖系数约为3(图 1)。

图1 ‘巴厘’菠萝组织培养过程

说明：A.无菌材料；B.不定芽；C.叶基；D.愈伤组织；E.从生芽；F.组培苗；G.生根情况；H.移栽情况。

1.2.2 愈伤组织、芽的诱导和增殖

将菠萝品种 ‘巴厘’吸芽的叶基接种在MS＋3 mg/L 6-BA＋2 mg/L NAA培养基上，诱导30 d后，从切口处产生结瘤状愈伤组织，诱导率约为60%。不同培养时间愈伤组织鲜重质量增加率结果表明，培养20 d后，鲜重增加率达到最大值，随后下降，因此，愈伤组织最佳继代周期为20 d(图2)。将愈伤组织转接于MS＋2.0 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L NAA的分化培养基上，26℃，1 500 lx的光照条件下进行培养，20 d后部分愈伤组织的球形节状表面出现小绿点，然后小绿点伸长长大，形成丛生芽。将丛生芽切成单株，转移到分化培养基上进行继代培养，芽逐渐长高，30 d后形成再生植株。继代周期为25～30 d(图 1)。

1.2.3 诱导生根

将获得的组培苗切成单株转接至培养基(MS＋2.0 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L NAA)中， 培养 25～30 d。 当不定芽长至株高2 cm左右、有3～5片叶时，将其沿基部切下，接到生根培养基上诱导生根，生根培养基为MS＋1.0 mg/L NAA＋0.5 mg/L IBA，培养条件同继代培养一致。培养15 d后小苗基部开始长根30 d后，长出10条左右较粗的根，生根率可达90%～100%(图 1)。

1.2.4 练苗移栽

为了提高组培苗的移栽成活率，在移栽前需进行练苗。当小苗有3～5条1 cm以上的不定根时，逐步开盖练苗3～5 d，取出小苗，将根部培养基洗去，晾干，移到透气性和保湿性良好的泥炭土中，浇定植的水，保持湿润，遮荫1～2周后长出新根和新芽。移栽成活率可达95%(图1)。

图2 不同培养时间愈伤组织鲜重质量增加率

2 存在问题及建议

在生产上，传统的菠萝繁殖方法是通过母体抽生的各类芽(冠芽、吸芽、裔芽)进行无性繁殖，存在繁殖系数低，种苗一致性差，易携带母体的病虫害，易发生变异，导致种质的退化等问题。此外，通过无性繁殖既制约了优良品种的推广和应用，也不利于品种的调整和改良。而利用组织培养技术可以获得大量脱毒且生产性状一致的种苗，满足生产需求，为进行品种的改良和更换提供技术支撑。研究人员通过对不同菠萝品种组织培养技术的研究，虽然建立了不同品种的再生体系，但都出现不同程度的植株变异，变异率约为0.031%～34%，阻碍了菠萝组培苗工厂化的进程[20-26]。因此，在菠萝组织培养过程中，如何减少或者避免体细胞无性系变异的发生，降低组织培养的成本，有利于推进菠萝工厂化育苗和品种的更新换代，加快菠萝产业化发展进程。