crispr提高基因编辑效率 基因编辑CRISPR技术学习

#创作挑战赛#

如果说近几年生物学技术最出风头的是哪个，非CRISPR基因编辑无疑了。

起初是在学界比较火热，在基因编辑婴儿出生后就变成了社会热点了。

涉事科学家“贺建奎”以非法行医罪入狱，最近出狱后于大兴落户开展基因合成方面的研究工作。

22年9月份发布的招聘启事

对于此人和事，我并不打算讨论，因为了解的信息比较少，思考的也比较浅薄。

这事发生在18年，作为一个植物学方面的学生，当时是在考虑将CRISPR技术应用到杨树和拟南芥的基因改造的，突然听说此事只是觉得情理之中，更有种来的太早的感觉。

不过后来仅仅是粗浅的了解了一下该技术，我本人并没有进行这个技术的实践，仅仅参与了原理学习和实验设计部分。

拟南芥的野生型和突变型的生长情况对比

前几日看到贺建奎发布的关于CRISPR技术在医学方面的应用，觉得应该继续学习一下这个技术，以跟进生物科学的进步。

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一. CRISPR的发现史

1987年，Nakata研究组在分析大肠杆菌（Escherichia coli）中基因iap及临近序列（flanking regions）时，偶然地发现在位于iap的3’端存在含有29个碱基的高度同源序列重复性出现，且这些重复序列被含32个碱基的序列间隔开，当时科学家并不清楚这种序列的生物学意义。随后的几年（1989年-1999年），陆续有相关研究指出类似的重复序列存在于多种细菌及古生菌中。2000年，Mojica和同事通过比对发现这种重复元件存在于20多种细菌及古生菌中，并将这种核酸序列命名为短规律性间隔重复序列（Short Regularly Spaced Repeats, SRSRs)，因其高度保守性，猜测其一定具有重要的生物学功能。

大肠杆菌图

CRISPR一词正式登上历史舞台还是2002年的事。Jansen实验室通过生物信息学分析，发现这种新型DNA序列家族只存在于细菌及古生菌中，而在真核生物及病毒中没有被发现，并将这种序列称为规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)。他们将临近CRISPR locus的基因命名为cas（CRISPR-associated），并发现了4个cas基因（cas1, cas2, cas3, cas4）。

2005年，Mojica，Bolotin和Pourcel三个研究组指出CRISPR中的间隔序列来自于外来噬菌体或质粒，其中Mojica实验室惊喜地发现病毒无法感染携带有与病毒同源间隔序列的细胞，而易侵入那些没有间隔序列的细胞，由此他们提出CRISPR可能参与细菌的免疫功能的假说。

CRISPR结构

（from 作者：制御秘书长杜鹃 https://www.bilibili.com/read/cv15465570/ j 出处：bilibili）

（到这里CRISPR被发现已是必然，从同源序列重复性出现被发现，到发现病毒无法感染携带有与病毒同源间隔序列的细胞，而易侵入那些没有间隔序列的细胞。

到这里CRISPR系统的功能已经被暗示的相对明显，剩下的是验证了）

CRISPR能在细菌的免疫功能中起作用在2007首次得到实验证实。Horvath研究组发现嗜热链球菌被病毒入侵后整合了来自噬菌体基因组新的间隔区序列，同样的病毒再次入侵时细菌就有了抗性，使其免遭攻击。同时人为地去除或添加特定的间隔区序列，会影响细菌的抗性表型。因此，他们认为CRISPR及cas基因一起为嗜热链球菌提供了对噬菌体的抗性作用，同时抗性的特异性取决于CRISPR中的间隔区序列，细菌的这种免疫性是可以遗传的。至此，虽然科学家并不清楚CRISPR/Cas抵抗病毒的具体机制，但他们开始逐渐揭开其神秘的面纱。

2008年，Oost实验室揭示了宿主细胞中CRISPR的间隔序列如何在cas蛋白的协助下介导发挥抗病毒作用。他们发现在CRISPR转录后，cas蛋白会形成一个称为Cascade的复合物，裂解每个重复单元中的CRISPR RNA前体（pre-crRNA），但裂解产物都保留了间隔序列。在解旋酶cas3的作用下，成熟的CRISPR RNA(crRNA)发挥小向导RNA（small guide RNA）的角色，促使Cascade干预病毒的增殖。2009年，Mojica团队指出前间隔序列临近的PAM序列为原核生物中CRISPR/Cas发挥免疫识别提供了靶标。

2011年，Charpentier研究组通过对人类病原体化脓性链球菌的差异化RNA测序，揭示了反式编码crRNA（tracrRNA）参与pre-crRNA的加工成熟过程。他们指出，tracrRNA通过24个核苷酸与pre-c中的重复序列互补配对，在保守的内源性RNA酶III和CRISPR相关的Csn1蛋白的参与下指导pre-cr RNA的成熟过程，这些组分对保护化脓性链球菌免受噬菌体DNA的入侵必不可少，研究揭示了crRNA成熟的新途径。

以上介绍CRISPR/Cas的发现及细菌、古细菌如何利用该系统来沉默外来核酸以抵御病毒及质粒的入侵。

CRISPR/Cas作为基因编辑系统被应用最早开始于2012年两位女神的强强联合，她们分别是来自加州大学伯克利分校的结构生物学家詹妮弗·杜德纳（Jennifer Doudna）和瑞典于默奥大学的埃马纽埃尔·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）。她们通过体外实验证明：成熟的crRNA通过碱基互补配对与tracrRNA形成特殊的双链RNA结构，指导cas9蛋白在目标DNA上引起双链断裂。在与crRNA指导序列互补的位点，cas9蛋白的HNH核酸酶结构域切割crRNA的互补链，而cas9蛋白RuvC结构域切割非互补链。当双tracrRNA：crRNA被嵌合到一条RNA时，同样可以指导cas9切割双链DNA。她们的研究证明，在双链RNA指导下切割双链DNA断裂的内切酶家族并揭示了CRISPR/Cas系统在RNA指导下进行基因编辑的巨大潜力。

之后就是各位大神在各种疾病、各种物种的CRISPR基因编辑实践，到目前发现、开发出各种应用方法。

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CRISPR 系统的工作细节

CRISPR/Cas9 系统的工作细节

不同类型的有一定的差异

对CRISPR系统的深入利用的基础是建立在自然界中本就存在的CRISPR 防御机制的认识发现上的。

二型CRISPR系统的结构，由CAS基因和CRISPR序列区组成

有几种不同类型的CRISPR系统，广泛较先被了解的是2型CAS9

CRISPR介导的细菌免疫机制（from金斯瑞）

CRISPR/Cas适应性免疫系统分为两个主要阶段：免疫获得和免疫效应。

在免疫获得阶段，Cas蛋白剪切外源性病毒DNA，然后将该外源性DNA作为间隔序列（Spacer）插入细菌基因组重复间隔区序列之间,插入位置为首个重复序列前。

在免疫效应阶段，当细菌再次感染病毒后，重复间隔区序列转录形成前体crRNA（Pre-crRNA）。随后Cas核酸内切酶在反式激活crRNA（tracrRNA）指导下与前体crRNA结合，经RNAse III剪切后形成成熟的 crRNA-Cas-tracrRNA复合物 。成熟的crRNA作为gRNA（GuideRNA,gRNA）与病毒DNA配对，触发Cas剪切活性进而干扰病毒DNA正常复制的。

CRISPR array 包含repeat序列和spacer序列, 这两种不同的序列是间隔开来的, 本着两个repeat序列夹一个spacer序列, 如上图所示, 黑色菱形代表repeat序列, 不同颜色的方形则代表了不同的spacer序列.

Repeat序列在同一细菌中的碱基组成和长度是相对保守的, 基本不变. 在不同的细菌之间会有些许差异. Spacer序列则是用来锚定目的外源基因的, 所以spacer的序列碱基组成差异较大, 因为他们来自于不同的外源基因. Spacer 基因当中包含着被锚定基因组中的特异性高的保守序列, 确保在之后转录出的RNA 可以与被锚定基因组精确配对. CRISPR array之前通常会有一个富含A-T的leader sequence, 这个序列中包含启动子, 是用来启动repeat 和spacer序列转录的. CRISPR array 不包含阅读框(ORF, open reading frame).

规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)，以上的repeat序列和spacer序列的重复排列以及repeat序列区含有回文序列（可以形成发卡结构）的情况和 规律间隔——成簇——短回文重复序列进行对应。

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困扰我的问题和CRISPR/Cas 系统的类别

困扰我良久的疑问：重复序列的回文能形成颈环结构的特征有什么生物学意义，是不是在pre-crRNA向crRNA的成熟过程发挥作用。

但是不少资料，如上一节的第一张图显示，crRNA的成熟过程是由Trans-RNA的互补介导的。下图展示的是另一种，pre-crRNA的repeats内部形成颈环结构，后被cas6或其他核糖核酸酶剪切形成crRNA.个人认为后者更为合理，但不排除两种机制都是存在的。

from Analysis of CRISPR Pre-crRNA Cleavage

怀着这样的疑惑在pubmed上翻了一段时间后，才知道这两种情况分别存在于不同类型的CRISPR/Cas 系统中。

from The crRNA Maturation Pathways of Class 1 and Class 2 CRISPR-Cas Systems

在1类系统中，CRISPR阵列被转录产生长长的pre-crRNA。Cas6家族酶识别重复结构或序列，并将RNA加工成中间或成熟的crRNA。在某些情况下（例如，I-A型和I-B型），Cas6充当二聚体来处理非结构化的前crRNA。

2类系统中的crRNA成熟度差异很大。在II型中，tracrRNA（红色）和pre-crRNA形成双链体，它们被Cas9结合和稳定。这使得宿主蛋白RNase III能够进行处理。中间crRNA通过未知的RNA酶进一步成熟。II-C型系统被描述为采用RNase-III非依赖性途径。

在这里，重复序列内的启动子序列能够进行内部转录和成熟crRNA的形成，形成结合Cas9的crRNA：tracrRNA双链体。在V-A型和VI型中，Cas12a和Cas13分别识别其重复序列的结构和序列，以便切割茎结构上游的pre-crRNA。在 V-A 型中，会发生额外的未表征处理事件。通过VI型Cas13处理产生成熟的crRNA。

条条大路通罗马，生物演化过程中并不会设计好一切，在演化力量和环境压力的共同作用下，总会走出不同的合适的路径生存下来。crRNA不同的成熟路径就是最好的例证，生命科学的美妙之处就在此。

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CRISPR的基因编辑方法

靶向目标序列：基因编辑的第一步也是最重要的一步就是在基因组上找到需要进行编辑的位置。基因组数据庞大复杂，例如人类的基因组DNA大小达到3GB。在庞大的基因组中定位到需要剪切的部位需要一个高效、精准的定位方法。

形成DNA断裂：定位到目标基因组位置以后，借助核酸内切酶在DNA双链上形成双 链DNA断裂，以此激发细胞本身的DNA修复机制。

修复断裂同时引入敲除或敲入：DNA双链断裂后，会激发细胞本身的DNA修复机 制。细胞的DNA损伤修复包含两种主要途径，一种是非同源性末端结合 （Non-homologous End Joining, NHEJ），即易错修复。NHEJ途径会在修复位点引 起随机插入或缺失，造成移码突变，使得基因不再表达，由此形成基因敲除。另一种是同源重组介导的修复（Homology directed repair, HDR），即精准修复。HDR途径能借助外源引入的单链或双链DNA为模板介导基因替换或插入，这种方式可以将一段DNA序列精准地插入特定的基因组位点，由此完成基因敲入或替换。

从实验角度来看，NHEJ的发生是因为未提供DonorDNA作为供体来进行HDR过程。

DNA断裂的修复是生物自救的本能，非同源末端连接(Nonhomologous end-joining,NHEJ)和同源重组(Homologousrecombination)两种修复DNA断裂的方式广泛存在于大多数生物体内，Donor DNA的提供是提高了同源重组可能。

在Donor DNA中引入突变信息是一种对DNA断裂的修复的巧妙应用，再结合CRISPR打断技术就是绝佳的精准突变目标DNA位点的手段了。

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方便的sgRNA

single guide RNA

天然的rRNA和tracrRNA复合物介导的Cas9剪切

人工设计的sgRNA介导的Cas9剪切

sgRNA设计基于自然界中天然存在的crRNA和tracrRNA。核苷酸1-32是天然存在的crRNA。核苷酸37-100是天然存在的tracrRNA。Briner等人在两个片段之间添加了-GAAA-接头，使它们成为一个单一的RNA片段。

sgRNA序列和二级结构

简化了CRISPR系统，这样就不必在实验中表达三种东西（即Cas9，tracrRNA和crRNA）。相反，只需要表达Cas9和sgRNA。部件越少，越可靠，系统效率越高。

sgRNA序列和二级结构以及设计思路

sgRNA二级结构，灰色矩形区域代表全长sgRNA支架中的额外的重复序列与其重复反义序列，在基因工程设计sgRNA时候通常是被去掉的。黄色区域代表sgRNA的3'尾巴，这对于Cas9功能不是必要的，在sgRNA-bound结构中是被省略掉的。

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CRISPR的失误“off-target”

失误在所难免，生命科学也在其中。

CRISPR切割目标DNA是依赖于sgRNA对靶序列的互补结合作用的。在当下优化后的工程化 CRISPR系统包含两个组件：一是Cas酶，特异性的切割其PAM位点上有的3和4碱基之间的，造成DNA链断裂。一是sgRNA，其一方面提供互补作用结合到目标靶序列，一方面提供特殊的一段序列和Cas酶结合，将Cas酶拉到目标序列旁边，使得Cas酶识别旁边的PAM位点后进行DNA切割。

实际生物基因组序列复杂度非常高，高度相似的序列往往存在，而在非完全匹配的情况下，CRISPR系统也是可以工作的。

因此在实际应用中脱靶效应是必须要考虑进去和考察的。

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CRISPR的技术扩展

张峰实验室对CRISPR系统做了一步小小的改造，才让Cas9系统有了其后的大放光彩。

这个问题说穿了会让人顿觉恍然大悟甚至觉得不值一提，Cas9系统无法使用在高等动物中的原因，仅仅是因为哺乳动物细胞具有细胞核和核膜，RNP（crRNA-cas9复合体）无法进入细胞核对DNA进行切割。张峰的做法是给cas9蛋白添加了SV40 NLS（Nuclear localization sequence），帮助Cas9进入细胞核。这样一来，哺乳动物细胞基因编辑的最后一个障碍也被克服了。

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CRISPR-PAM-Cas

CRISPR靶向特异性是由两部分决定的，一部分是RNA嵌合体和靶DNA之间的碱基配对，另一部分是Cas9蛋白和一个短DNA序列，这个短的DNA序列通常在靶DNA的3‘‘末端作用，被称为protospacer adjacent motif（PAM）。

PAM（CRISPR序列临近的3个核苷酸NGG为PAM）作为CRISPR序列在基因组上的一个标记，对于靶向识别至关重要，靶向识别的结果是Cas9的两个核酸内切酶结构域(两把”分子剪刀“)将PAM前的3-4核苷酸间的3'-5’磷酸二酯键切断，造成DSB（双链断裂）。

CRISPR介导的细菌免疫机制（from金斯瑞）

CRISPR/Cas适应性免疫系统分为两个主要阶段：免疫获得和免疫效应。

在免疫获得阶段，Cas蛋白剪切外源性病毒DNA，然后将该外源性DNA作为间隔序列（Spacer）插入细菌基因组重复间隔区序列之间,插入位置为首个重复序列前。

在这个阶段Cas9是通过识别病毒DNA中的PAM（NGG）位点后进行切割，才有后续一系列反应的。

在免疫效应阶段，当细菌再次感染病毒后，重复间隔区序列转录形成前体crRNA（Pre-crRNA）。随后Cas核酸内切酶在反式激活crRNA（tracrRNA）指导下与前体crRNA结合，经RNAse III剪切后形成成熟的 crRNA-Cas-tracrRNA复合物 。成熟的crRNA作为gRNA（GuideRNA,gRNA）与病毒DNA配对，触发Cas剪切活性进而干扰病毒DNA正常复制的。

在这个阶段，Cas9在其结合gRNA的指引下结合到PAM前的序列，然后识别PAM后进行切割工作。换句话说，就是说gRNA将PAM放到Cas9面前。

from金斯瑞

Cas蛋白的PAM特异性是可改造的。

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CRISPR拓展应用

from金斯瑞

利用CRISPR/Cas能特异性的结合特定序列的性质，进行改造应用。

逆练武功的CRISPR介导的ChIP技术

染色质免疫沉淀技术（Chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是研究DNA 与蛋白质相互作用的主要方法。

传统的ChIP是靶定特定蛋白质，在活细胞状态下固定蛋 白-DNA复合物，将其随机切断为片段，然后通过免疫学方法特异性地富集目的蛋白结合 的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

CRISPR/Cas9介导的ChIP是反向的，即靶定基因组区域然后鉴定哪种蛋白质在那里。通过将细胞核定位信号和表位标签引入催化失活的Cas9 （dCas9），可形成通过gRNA 靶向的DNA结合蛋白。

现有gRNA数据库和设计工具能够靶向任何目的基因。而 dCas9与染色质形成的复合物可以用传统的染色质免疫沉淀 （ChIP） 技术进行纯化，并 通过质谱进一步鉴定。

CRISPR介导的CHIP技术已被用于识别与干扰素调节因子1 （IRF-1） 的启动子区 域相关的蛋白，其受到干扰素γ刺激会产生反应。在该研究中，研究人员纯化了15种相关蛋白，包括组蛋白脱乙酰基酶复合物以及转录因子、组蛋白和其他DNA相关蛋白。相比传统的CHIP方法，CRISPR介导的CHIP具有众多优势。

传统的ChIP的大规模分析需要使用靶向每种DNA结合蛋白的多个抗体或者生成并表达表位标记蛋白，但 CRISPR/Cas9系统的模块化特性只需靶向Cas9蛋白的单个抗体进行纯化。此外， CRISPR/Cas9系统不受基因表达水平低、差异基因表达或毒性基因表达等问题的影响。

巧妙改造的CRISPRi/CRISPRa

利用dCas9无核酸内切酶活性但仍能与DNA结合的特点设计的CRISPR/dCas9系 统，可按照预先设计的gRNA靶向特定基因的转录起始位点上游，同时结合转录激活或抑 制相关因子启动或终止靶向基因的转录来调控靶基因的表达。

博德研究所的张锋实验室率先将CRISPR/Cas9协同转录激活调节子 （SAM） 系统 应用于基因激活试验。SAM系统能够强效激活内源性基因的转录，其通过gRNA靶向结 合到转录起始位点上游200 bp内的位置。利用SAM系统激活基因表达方面的研究表 明，通过转录激活，可使部分基因的转录提高到原来的3000倍。同时SAM系统具有 多重基因激活能力，可同时激活10个基因的转录。此外研究还证明SAM可激活非编码元 件，如基因间区长链非编码RNA。使用靶向全基因组的SAM gRNA文库进行功能获得性筛选，可快速鉴定出疾病模型 或发育/分化过程中控制目的表型出现的关键基因42。博德研究所设计的靶向人全基因组 SAM文库针对每个基因设计3种不同的gRNA，每个gRNA靶向23430个编码亚型中的一 个，这些亚型包含人类基因组中独特的转录起始位点，该SAM文库总共包含70290条 gRNA。

其余的CRISPR活体成像也是基于对Cas蛋白的目的性改造完成的。

可以说CRISPR系统的发现和应用极大地促进了DNA/RNA和蛋白互作的操作水平。

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CRISPR/Cas系统的医疗应用

遗传性疾病的纠正

CRISPR/Cas9最令人兴奋的应用之一是它可用于治疗由单基因突变引起的遗传性疾病。此类疾病的例子包括囊性纤维化 （CF）、杜氏肌营养不良症 （DMD） 和血红蛋白病。到目前为止，这种方法目前仅在临床前模型中得到验证，但有希望很快将其转化为临床实践。

Schwank等人使用CRISPR / Cas9来研究CF的治疗。使用从两名CF患者获得的成人肠道干细胞，他们成功地纠正了肠道类器官中引起CF的最常见突变。他们证明，一旦突变被纠正，CF跨膜导体受体（CFTR）的功能就会恢复。另一种已经研究CRISPR / Cas9的疾病是DMD。Tabebordbar等人最近使用腺相关病毒（AAV）递送CRISPR / Cas9核酸内切酶，通过删除含有原始突变的外显子来恢复DMD小鼠模型中的肌营养不良蛋白表达。这会产生截短但仍然起作用的蛋白质。治疗的小鼠被证明可以部分恢复肌肉功能缺陷。值得注意的是，在补充成熟肌肉组织的肌肉干细胞中编辑了肌营养不良蛋白基因。这对于确保CRISPR / Cas9的任何治疗效果不会随着时间的推移而消退非常重要。

两项类似的研究描述了在体内使用CRISPR / Cas9系统来增加肌营养不良蛋白基因的表达并改善DMD小鼠模型中的肌肉功能。其他研究使用CRISPR / Cas9在体外靶向人类肌营养不良蛋白基因中外显子的重复，并表明这种方法可以导致DMD个体的肌管中产生全长肌营养不良蛋白。

CRISPR / Cas9也可用于治疗血红蛋白病。Canver等人最近发现，CRISPR/Cas9破坏BCL11A增强子可以在小鼠和原代人红细胞中诱导胎儿血红蛋白。将来，这种方法可以使胎儿血红蛋白在成人血红蛋白异常的患者中表达。对于患有镰状细胞病或地中海贫血等疾病的患者，这将代表一种新的治疗策略。

艾滋病毒的治疗

CRISPR/Cas9的另一个潜在临床应用是治疗传染病，如HIV。虽然抗逆转录病毒疗法为艾滋病毒提供了有效的治疗方法，但由于病毒永久整合到宿主基因组中，目前尚无治愈方法。

Hu等人表明，CRISPR / Cas9系统可用于靶向HIV-1基因组活性。这种灭活的HIV基因在各种细胞中的表达和复制，这些细胞可以潜伏感染HIV，而没有任何毒性作用。此外，细胞也可以针对HIV-1感染进行免疫。这是克服当前如何消除感染者艾滋病毒问题的潜在治疗进展。经过进一步的改进，作者认为他们的发现可能使基因疗法或基因改变的骨髓干细胞或诱导多能干细胞的移植能够根除HIV感染。贺先生就是因为相关应用进去的。

体外工程体细胞治疗恶性肿瘤或其他疾病

人们对使用CRISPR / Cas9修饰患者来源的T细胞和干细胞/祖细胞的可能性越来越感兴趣，然后可以将其重新引入患者体内以治疗疾病。这种方法可以克服与如何有效地将基因编辑传递给正确细胞相关的一些问题。

T细胞基因组工程已经在治疗血液系统恶性肿瘤方面取得了成功，并有可能治疗实体癌，原发性免疫缺陷和自身免疫性疾病。T细胞的遗传操作以前效率低下。然而，舒曼等人最近报道了一种基于CRISPR/Cas9系统的人类CD4 T细胞更有效的方法。他们的技术允许对原代人类T细胞中的基因组进行实验和治疗性敲除和敲入编辑。他们证明T细胞可以以防止PD-1蛋白的表达，其他研究表明，这可能允许T细胞靶向实体癌。

人们也有兴趣在多能干细胞或原代体细胞中使用CRISPR / Cas9介导的基因组编辑来治疗疾病。例如Xie等人12表明，引起β地中海贫血的突变可以在人诱导的体外多能干细胞中得到纠正。他们认为，在未来，这种方法可以为骨髓移植提供细胞来源，以治疗地中海贫血和其他类似的单基因疾病β。

局限性

在将CRISPR/Cas9的潜力转化为临床的有效治疗之前，仍然存在许多挑战。一个特殊的问题是如何将基因编辑传递给正确的细胞，特别是如果要在体内进行治疗。为了在体内安全地递送编码Cas9核酸酶基因并引导RNA而没有任何相关毒性，需要合适的载体。AAV以前一直是基因传递的首选选择。然而，这种递送系统可能太小，无法有效转导Cas9基因。可以使用较小的Cas9基因，但这对疗效有额外的影响。 许多其他非病毒递送系统正在研究中，这一过程需要进一步优化。

另一个重要的问题是，脱靶效应。基因组的错误编辑可能会给患者带来严重的长期并发症，包括恶性肿瘤。在限制脱靶活性时，Cas9核酸酶的浓度和Cas9表达的时间长度都很重要。尽管最近对核酸酶的修饰提高了特异性，但需要进一步的工作来最大限度地减少脱靶效应并确定任何治疗的长期安全性。

本文中考虑的CRISPR / Cas9的治疗应用主要针对体细胞。围绕CRISPR / Cas9的一个特别有争议的问题是胚胎中的基因编辑。已经表明，CRISPR / Cas9技术可以改变人类胚胎3的基因组，理论上可以证明可用于遗传疾病的植入前治疗。然而，种系的任何基因改造都是永久性的，长期后果尚不清楚。许多人在任何情况下都反对种系修饰，理由是最终后果可能是非治疗性遗传增强。

from金斯瑞

此外，可以使用CRISPR/Cas9的伦理界限仍有待完全确定，该技术有可能彻底改变许多儿科疾病的治疗，在临床实现这种潜力之前，必须克服许多实际和道德挑战。

和许多新兴科技一样，基因编辑也是一把双刃剑。慎重使用是负责的态度，不必恐慌，不必苛责。潜在的受益人是所有人的技术是值得的。

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