pcr对单链dna的线性扩增（qPCR芯片研究抗菌肽P1转基因鱼免疫相关基因）

作者：上海启因生物

文章标题：

A pathway-focused RT-qPCR array study on immune relevant genes in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) harboring cecropin P1 transgene

Yueh-Chiang Han，Thomas T.Chen

Fish and Shellfish Immunology（IF=3）

DOI: doi.org/10.1016/j.fsi.2019.03.027

研究背景：

研究抗菌肽P1转基因鱼对微生物病原体感染的抗性。

方法

对实验室已有的不同家族的抗菌肽P1转基因虹鳟鱼取肝、肾、脾等样本共36个，进行qPCR检测（wcgene biotech， 上海启因生物）和基因序列分析。

结果

1. 转基因脾脏免疫相关通路差异表达基因的分析

表1.通过RT-qPCR芯片测定转基因鱼（F231，F509和F695）脾脏中的差异表达基因（DEG）情况

图1 三种转基因鱼（F231, F509, F695）中在趋化因子/细胞因子JAK-STAT信号通路（A）、Toll样受体信号通路（B）、补体和凝血的通路（C）、抗原加工和呈递（D）、溶酶体/吞噬作用途径（E）、白细胞跨内皮迁移途径（F）上调、下调表达的基因。

如图1A所示，在所有三个家族中，与导致趋化因子/细胞因子JAK-STAT信号通路的配体-受体结合相关的基因的表达持续上调；这些基因包括ccr9、cxcr3、cxcr4、cxcl11、cxcl12、il6st和il21r(图1A)。虽然stat1的STAT转录因子(STAT1和stat6)和靶基因(c4)的表达增加，但STAT1的另一个靶基因(irf7)显著降低。虽然ccr8的表达在F231鱼类家族中表现出抑制，但是在F509和F695鱼类家族中表现出增加的表达。在Tolllike受体信号通路中，三个不同TLR(TLR 2、tlr3和tlr7)、重要衔接子(myd88)、干扰素调节因子(irf3)及其靶基因(cxcl11)的表达在三个家族中都上调(图1B)。然而，tnfrsf5 (cd40)的irf7和IRF3靶基因的表达受到抑制。在补体和凝结级联途径中，在结合配体(mbl)和三种补体成分(c4、c6和c7)的基因中观察到一致的表达水平升高(图1C)。在抗原处理和呈递途径(图1D)中，逆转录-qPCR阵列数据显示hspa4、hspa5、cd4、calr和b2m中表达水平升高，但是观察到两种主要组织相容性复合体(MHC)即mhc1和mhc2的下调。此外，组织蛋白酶B和L (ctsb和ctsl)以及溶酶体/吞噬作用途径中的必需膜糖蛋白(lamp2)持续上调(图1E)。在白细胞跨内皮迁移途径中，三种重要的整合素(itgb1、itgb7和itga4)和粘附配体(cxcl12)以及关键胶原酶(mmp9)被显著刺激(图1F)。

2. 转基因肾脏免疫相关途径差异表达基因的分析

表2 肾脏中免疫相关途径的DEGs表达水平的结果

图2虽然白细胞跨内皮迁移途径中关键整合素基因(itgb1、itgb7和itga4)和结合配体基因(cxcl12)的基因表达水平显著升高(图2A)，胶原酶基因(mmp9)也上调，但在三种鱼转基因肾脏中观察到调节细胞外基质组织的纤连蛋白(fn1)和层粘连蛋白(lambin 2)基因表达水平的抑制(图2B)。

3. 转基因肝脏免疫相关途径差异表达基因的分析

表3转基因虹鳟肝脏中的免疫途径相关的DEG的芯片分析结果

图3 如图3A所示，在三个转基因鱼科中，PPAR信号传导和脂质代谢过程途径中重要的膜转运蛋白/同工酶（slc27a2）和磷脂转移蛋白（pltp）基因的表达差异性增强。相反，转基因肝脏中信号受体（ppar-α和rxr-γ）及其下游靶基因（cyp27a1）的mRNA水平受到抑制。有趣的是，虽然脂肪酸结合蛋白（fabp1）的mRNA水平在F509和F695的转基因鱼科中上调，但它在F231家族中被下调。与花生四烯酸代谢途径相关的DEG被下调，包括cyp2j2和pla2g12b（图3B）。最后，在所有三个转基因家族中，溶酶体/吞噬作用途径中的组织蛋白酶D和S（ctsd和ctss）被一致地抑制（图3C）。有趣的是，膜糖蛋白基因（lamp2）的表达在转基因鱼科F231和F695中得到增强，但它在家族F509中受到抑制。

结果总结

结果表明除了其直接的杀微生物活性外，抗菌肽P1的转基因产物在转基因宿主中诱导免疫调节活性。

qPCR芯片技术为水产养殖中抗病鱼苗的选育提供了一种快速，有效，廉价的筛选方法。这项研究还可能鼓励进一步探索相关的科学研究课题，如海洋物种中抗菌肽（AMPs）的组织分布，微生物感染效应和蛋白质组学研究。

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