mnm重组（illumina收购mNGS明星公司了）

来源：小桔灯网

作者：是金克斯不是爆爆

在政策的“锤摆”尚未落地之际，肿瘤NGS市场的热度话题确实应该降降温了。今天我们来看看基因测序市场的另一片必争之地[ mNGS]技术。毕竟，mNGS与肿瘤NGS共同扛起了现阶段基因测序市场发展的大旗。

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前情回顾

6月24日，Illumina 收购mNGS明星公司IDbyDNA公司成为国内IVD人打工饭后畅聊的话题，此次的收购双方将致力于共同营销 IDbyDNA 的 Explify 平台，与此同时推进Illumina 的 NGS 仪器和文库制备试剂盒在mNGS医疗市场中的投放。这场收购的核心亮点是，IDbyDNA为illumina提供了一种呼吸道病原体Panel富集试剂盒，该可识别 280 多种病原体，包括 SARS-CoV-2以及 1200 多种抗菌素耐药性等位基因。另外，作为收购的一部分，IDbyDNA 联合创始人兼首席医疗官 Robert Schlaberg 以杰出科学家、传染病和副总裁的身份加入 Illumina。

Robert Schlaberg, MD, Dr Med, MPH

医院主任：致力于传染病疾病

教育

硕士学位—公共卫生，哥伦比亚大学梅尔曼公共卫生学院

医学学位—维尔茨堡大学

Dr.med—维尔茨堡大学

住院医师——哥伦比亚大学瓦格洛斯内科和外科医生学院临床病理学主任住院医师

认证机构：美国病理学委员会（临床病理学、医学微生物学）

研究方向：宏基因组学 NGS在临床微生物学中的诊断应用

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病原微生物高通量二代测序技术

近年来，人体微生物组学与健康/疾病的关系已成为生物医学研究领域的热点，具有潜在的临床应用前景。

mNGS

所谓宏基因测序—Metagenomics，是对环境样品中的微生物群落的基因组进行高通量测序，主要研究微生物种群结构、基因功能活性、微生物之间的相互协作关系以及微生物与环境之间的关系。宏基因组测序研究摆脱了微生物分离纯培养的限制，扩展了微生物资源的利用空间，为环境微生物群落的研究提供了有效工具。从技术层面来说，mNGS是一种对临床样本中的所有核酸进行测序，然后与各个物种的基因组序列对比，从而寻找可能病原体的方法。mNGS不仅可以大大缩短标本周转时间，还能及时为临床提供准确有利的诊疗依据。

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mNGS在病原体检测中的应用

检测新发未知病原体：近年来，不同病毒 的交叉重组、重配所导致的新发传染病暴发越来越频繁。传统ＰＣＲ检测技术的瓶颈是需要根据已知病原体序列信息预先设计引物，而 ｍＮＧＳ能够对临床样本中的所有核酸序列进行无偏倚测序，能快速鉴定新发病原体（新冠病毒的检测就是一个非常好的应用案例）。值得一提的是，病原微生物的样本需要mNGS技术做出超乎寻常的准确性，因为人源宿主信息和微生物宿主信息的占比大约为1亿：1，而mNGS技术针对的是病原的遗传信息，在面对超级海量的人源宿主核酸干扰时，犹如大海捞针，实现结果的准确性是mNGS技术发展的重要前提。

检测罕见病原体：罕见病原体感染是临床非常棘手的难题，由于常规检测方法不能覆盖，往往导致误诊或漏诊。

检测跨物种传播病原体：随着全球化进程， 曾经局限于小范围、特定物种的病原体越来越多地 发生跨地域、跨物种传播。ｍＮＧＳ 可揭示先前无法 区分的动物来源和人类来源病原体的差异，可追踪 潜在的人兽共患疾病起源。

检测混合感染病原体：传统微生物检验具有 偏向性，只能检出部分病原体，而 ｍＮＧＳ 可无偏向性地同时检出所有感染的病原体，为患者明确诊断 节省了时间。

检测培养阴性的细菌／真菌性病原体：针对细菌和真菌感染，公认的“金标准”检测方法是培养，但由于抗菌药物的应用、标本运送不及时、培养 基及培养条件选择不正确等因素可能导致培养阴性。

传统微生物检测方法

传统的微生物鉴定方法分为培养和非培养两类。临床公认的“金标准”是分离培养和生化鉴定，这种方法的操作周期长、失败率高，并且不是每种病原体都可以培养。不依赖培养的方法，比如涂片镜检、抗体抗原免疫等，在采样当天即可报告结果，这些方法的时效性强，但在敏感性和特异性又存在较明显的劣势，而且传统的微生物鉴定方法无法快速识别未知或者罕见的病原微生物。

mNGS不依赖于传统的微生物培养，也无需特异性扩增，可直接对临床样本中的核酸无差别、无选择性地进行高通量测序，与已知微生物序列数据库进行比对分析，根据比对到的序列信息来判断样本包含的病原微生物种类，能够快速、客观地检测临床样本中的病原微生物（包括病毒、细菌、真菌、寄生虫）。

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mNGS纳入多部疾病诊疗专家共识

凭借着上述优势，mNGS逐渐地在（某些区域正大范围）地被一些临床医生认可和尝试使用，相关的临床指南和专家共识也对mNGS有所提及：

2021年2月，“宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识” 在《中华检验医学杂志》发布。共识由来自全国60余家单位的专家组成员讨论撰写。北京大学人民医院王辉教授为通讯作者。该共识主要对该技术的临床适应证、实验流程、质量管理、性能验证和报告解读等问题给出推荐意见和解决方法，促进该技术规范和发展，为临床抗感染诊治提供帮助。

2020年11月15日，“中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识” 在《中华传染病杂志》发布。共识由来自全国18家单位的共22位编写专家组成员讨论撰写。复旦大学附属华山医院张文宏教授为通讯作者。

作为全球首篇针对所有感染性疾病的宏基因组学临床应用专家共识，在二代测序病原检测技术越来越普及的当下，该共识的发布对感染病宏基因组学病原诊断的应用具有里程碑式的重要意义，建立了中国感染病原体宏基因组学检测的标准规范。也是中国感染病宏基因组学的阶段性成果总结。

2019年中华急诊医学杂志发表了《宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识》，是国内第一篇关于mNGS临床应用的专家共识。该共识对mNGS在急危重症感染患者的应用、检测的基本流程、质量控制以及临床应用和结果解读原则等做出详细概述，为宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染的应用指明方向。

同一年中，nature杂志推出了业内顶级专家主笔的关于临床宏基因组的重量级综述，介绍了宏基因组测序在临床应用发展中的重要进展，临床宏基因组正在逐渐改变医生诊断和治疗感染性疾病的方式。作者预测在未来5年内，评估mNGS临床效用和成本效益的前瞻性临床试验数据将会越来越多，mNGS的总体成本和周期将持续下降，它的应用方向不仅仅是识别病原体，在人体宿主反应和微生物组数据的整合方面也将发挥着重要作用。

《中国利什曼原虫感染诊断和治疗专家共识》提到：有文献报告用二代测序等方法成功诊断骨髓穿刺与活组织检查未能发现的病例，将来有可能应用于临床。

《儿童呼吸道感染微生物检验标本采集 转运与检测建议（细菌篇）》指出：全基因组测序是对感染性疾病病原体的大规模核酸分析，可提供极为丰富的信息，对于未知病原体的发现具有不可比拟的优势，是分子生物学诊断的研究热点。

《儿童呼吸道感染微生物检验标本采集 转运与检测建议（病毒篇）》提到：二代测序技术不但在高通量方面表现出优势，而且在发现新病原方面也有突破性进展，但目前二代测序的结果还需要验证，不能直接用于临床诊断，要广泛应用尚待时日。

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mNGS在新型冠状病毒检测中的挑战

尽管mNGS在鉴定新发病原体、鉴定混合感染等方面具有天然优势，但由于其方法学的特点，作为新型冠状病毒一线筛查的诊断方法还存在一些不足。

01 检测周期较长：

现阶段mNGS的检测模式主要由各临床单位外送至第三方检测机构，少数医院通过自建、共建实验室等方式也实现了院内检测，但是mNGS方法学流程就决定了其最快检测周期为24h，平均检测周期约48h或更长，相较于RT-PCR平均3~5 h的检测周期，相对来说mNGS在新型冠状病毒的快速筛查上不具备优势。

02 流程复杂并缺乏标准化：

与RT-PCR相比，mNGS的实验过程更加复杂，其核酸提取、文库构建、上机测序、数据分析和报告解读这五个步骤所涉及的仪器和试剂众多，对检测人员和数据分析人员的资质要求也更高。

另外，现阶段国内权威机构尚未颁布mNGS临床应用指导原则与标准化操作流程，也就是说检测病原体的时候并没有一个统一标准的阈值，易导致不同人做出的试验，其阳性率不同。同时，差异化的质控流程、前处理/核酸提取方式、建库方式、测序平台、生信分析流程及解读规则致使国内现阶段企业的mNGS流程多样化，复杂的检测流程与前沿的方法也使得大部分临床单位并不具备开展mNGS检测的能力。如此看来，mNGS或较难实现基层医院的院内检测。

03时间和成本控制下的部分样本测序深度不足：

从方法学上来说，二代测序可以提供足够的测序深度，但是mNGS的常规临床应用还需要考量检出时间和成本等因素。在有效去除人源宿主的情况下，mNGS可以在24 h内单流程产出5×10^6~24×10^6数据量（1 000万~2 400万条测序序列）以满足疑难、危重、特殊感染患者的病原体鉴定需求。

对于病毒而言，不同区域的特异性检测序列数只要达到3条即可实现准确鉴定；对于部分病毒载量高的样本，甚至可以将测序得到的大量核苷酸片段进行拼接，从而获得目标病原体的全基因组片段进行进化与突变分析。但是对于部分病原体载量较低的样本，上述测序深度可能不足以实现病原体的准确鉴定。增加测序深度是提高检出率与比对准确度的可选方案，但同时也意味着检测成本的升高和检测时间的延长。如何平衡测序数据量与检测成本和检测时间是部分病原体低载量样本必须要考量的因素。

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mNGS技术的医疗监管及审评重点

mNGS作为一项优势明显的技术，向产业化转变是必然趋势，在相关医疗器械监管过程中，尤其是体外诊断试剂审评过程中，以下方面应该重点考虑。

1. 规范临床适用人群及临床适应证：根据目前的临床经验、研究结果和mNGS技术的优势，mNGS的临床适用人群应以急危重症感染患者为主，其主要适应证包括：①病情危重需要尽快明确病原体；②特殊病人，如免疫抑制宿主、合并基础疾病、反复住院的重症感染患者，需要尽快明确病原体；③传统微生物检测结果反复阴性且治疗效果不佳；④疑似新发病原体、临床上提示可能有一定的传染性；⑤疑似特殊病原体感染；⑥长期发热和/或伴有其他临床症状、病因不明的感染。

2. 应结合患者负担和收益比，重点对产品的临床意义进行审评。

3. mNGS可以早期发现病原体，指导抗菌药物的精准选择，减少抗菌药物的使用，降低患者病死率，但尚需要大样本的研究证实，因此，mNGS在临床试验阶段应根据其产品设计，选择预期用途的适用人群进行足够样本量的验证。同时，由于mNGS产品临床可能的适用人群的特殊性和罕见性，入组足够数量的人群可能会存在较大困难，这一点可能会是临床试验审评中的难点。

4. 对于感染严重、生命体征不稳定的患者，由mNGS获得致病病原体后，针对病原体进行精准治疗，治疗后应密切随访患者的临床表现和治疗效果，应有随访数据。

5. 病原特征数据库与算法要有系统研发，对算法的审评应结合数据库一起作为审评的重点环节，不能简单认为把公共数据库中的微生物数据纳入越多越好。

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写在最后

宏基因组二代测序，作为一种新兴的辅助诊断技术，克服了多数病原体不能培养以及传统检测方法周期长，假阳性假阴性率高，依赖预判等弊端，在感染类临床应用中发挥着越来越重要的作用，相信在不久的将来，它将逐步解决病原体鉴定中的困难和问题，进一步推动临床微生物和感染病学的发展，让更多患者受益。

参考文献，感谢下述文献及作者对本文给予的帮助：

1. 戴媛媛, 马筱玲. 宏基因组二代测序技术在临床病原学诊断中的应用[J].临床检验杂志, 2021, 39(1): 1-5. DOI: 10.13602/j.cnki.jcls.2021.01.01.
2. 《中华传染病杂志》编辑委员会 . 中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识[J].中华传染病杂志, 2020, 38(11): 681-689. DOI: 10.3760/cma.j.cn311365-20200731-00732.
3. 宏基因组分析和诊断技术概述/胡鹏/国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心临床与生物统计二部

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