靛酚蓝比色法的优缺点（土壤脲酶如何测定）

土壤脲酶是作用于线型酰胺的C—N键(非肽)的水解酶，一般脲酶含量和微生物有机质等呈正相关，能酶促土中尿素水解成氨，故也在一定程度上代表氮含量的状况。今天就和大家分享一下如何通过靛酚蓝比色法对土壤脲酶进行测定。

一、实验试剂

1.10%尿素：称取10g尿素，用蒸馏水溶至100ml。

2.柠檬酸盐缓冲液（PH=6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。

3.苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量无水乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用无水乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。

4.次氯酸钠溶液：用水稀释试剂至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。（9ml—100ml中）

5.氮的标准溶液（0.1mg/ml）：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液。

6.甲苯

二、主要仪器

万分之一分析天平、恒温摇床、分光光度计、温度计

三、试样的制备

取风干的实验室待测样品充分混匀后，按四分法缩减至100g，粉碎，然后全部通过18目孔径筛，装入样品袋备用。

四、实验过程

4.1.标准曲线的测定

吸取10ml氮的标准溶液定容至100ml，摇匀。从其中分别吸取0，1.00，3.00，5.00，7.00, 10.00ml移至50ml比色管中，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠的溶液，充分混合。紧接着加入3ml次氯酸钠，随加随摇匀，放置20分钟,用水稀释至刻度。将显色液在可见分光光度计上于578nm处，进行比色测定，以试剂空白为参比。以标准溶液氮含量为纵坐标，以吸光度值为横坐标绘制标准曲线。

4.2.土样中脲酶活性的测定

分别称取2-5g风干土样于50ml离心管中，向其中加入1ml甲苯，以使土样全部湿润为宜。放置15分钟后，加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（pH=6.7），并摇匀。将锥形瓶放入37℃恒温箱中，培养24h。培养结束后，用热至38℃水稀释至刻度，充分摇荡，离心，过滤。分别吸取（1-3ml）滤液于50ml比色管中，加蒸馏水至20ml，充分震荡，然后加入4ml苯酚钠，充分混合，再加入3ml次氯酸钠充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度，溶液呈现靛酚的蓝色（在1h内保持稳定）。于578nm处进行比色测定。

4.3.无土对照

不加土样，其他与实验同，以检验试剂忖度，整个实验设1个。

4.4.无基质对照

以等体积水代替基质，其他与实验相同。 土壤脲酶活性以24小时1g土壤中NH3－N的毫克数表示。

五、结果计算：

以24小时后1g土壤中NH3－N的毫克数表示土壤脲酶活性（Ure）。

Ure=（a样品－a无土－a无基质）×V×n／m

式中：

a样品为样品吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数；

a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数；

a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数；

V为显色液体积；

n为分取倍数，浸出液体积／吸取滤液体积；

m表示烘干土重

来源：栢晖生物整理