食品中霉菌毒素的限量（动物源性食品中霉菌毒素的检测）

赭曲霉毒素（ochratoxins，PT）是一组结构类似的真菌毒素，主要有A、B、C三种化合物，其中毒性最大、与人类健康最密切、产毒量最高、对农作物的污染最重、分布最广的是赭曲霉毒素A（OTA）。OTA是被国际癌症研究机构（IARC）确定为Ⅱ（B）类致癌物的一种真菌毒素。OTA首先在玉米中被发现，以后又相继从谷物和大豆中被检出。动物饲料中OTA的污染也非常严重，动物进食被OTA污染的饲料后导致体内OTA的蓄积，而且OTA不易被代谢降解。本部分综述了OT的理化性质、毒理与危害、国内外限量要求以及残留检测的样品前处理、仪器测定方法等内容，以期为该类污染物的全面了解和残留检测提供参考。

1 理化性质

OT是由曲霉菌属和青霉菌属几种真菌产生的次生代谢产物，OTA、OTB、OTC的差异在于OTB是OTA的氯原子被氢原子取代，OTC是OTA的乙酯化合物。其中OTA分子式为C20H18CLNO6，相对分子质量为403.8。OTA纯品为白色针状晶体化合物，溶于极性有机溶剂，微溶于水。在紫外线照射下呈绿色荧光，在苯溶液中最大吸收峰为333nm，在纯乙醇溶液中最大发射波长为467nm。OTA具有耐热性，焙烤只能使其毒性减少20%，蒸煮对其毒性不具有破坏作用。

OTA的苯丙氨酸基团可被其他氨基酸取代形成OTA的类似物。它被酪氨酸、缬氨酸、丝氨酸取代形成的类似物毒性强于被蛋氨酸、色氨酸取代形成的类似物，被谷氨酸、脯氨酸取代形成的类似物毒性较低。OTA有2个羧基和羟基电离基团（图4-8），在生理条件下以电离和非电离的形式存在。羟基基团以电离形式存在是OT具有毒性所必需的。

2 毒理学

关于OTA在动物体内的代谢机制目前还不十分清楚。动物代谢试验发现，OTA能被哺乳动物胃肠道内的羧肽酶A和微生物水解成毒性较低的产物，如OTα和苯丙氨酸。亦有研究表明OTA主要被动物体内的多功能氧化酶通过羟化作用降解为低毒性的4-R-羟化-OTA（OTA-OH）。OTA代谢的半衰期不仅有种属差异，而且还有组织器官差异，如OTA在大鼠体内的半衰期为103h，在牛体内的半衰期为90h，而在雏鸡体内的半衰期仅为4h；OTA在大鼠肝脏内的半衰期为60h，在肾脏中为54h，在心脏中为48h，在肌肉中为97h，而在血液中为103h。许多研究结果证实OTA与血清蛋白的结合力与其在血液中的半衰期长短有直接关系，即OTA与血清蛋白的亲和力大于OTA与组织蛋白的亲和力，故OTA在血液中的半衰期较在其他组织中的半衰期长。

（1）影响蛋白质的合成 研究发现低剂量OTA即可降低实验动物肝脏和肾脏中苯丙氨酸羟化酶的活性。分别给雌性大鼠每天喂饲50μg/kg的OTA，10d和35d后苯丙氨酸羟化酶的活性显著降低，尽管OTA在肾脏中的浓度高于在肝脏中的，但是这种抑制作用在肝脏中更为明显。同样的抑制作用也出现在体外试验中。OTA和苯丙氨酸联合作用可以减少对苯丙氨酸羟化酶的抑制，特别在肝脏中更为明显。此外研究还发现OTA能与苯丙氨酸竞争苯丙氨酸-tRNA结合位点，从而抑制蛋白质的合成。但亦有研究发现在试验中加入苯丙氨酸并不对OTA引起的细胞毒性有减轻作用。故还需要做进一步的研究，以确定OTA是否对苯丙氨酸在体内的代谢转化有影响。

（2）造成氧化应激损伤 许多学者认为氧化应激是OTA毒性的一个重要机制。研究证实，所有的细胞成分包括核酸、蛋白质及脂类等均可受到自由基反应的损害；而参与抗氧化作用的酶包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、过氧化氢酶等能消除自由基，防御过氧化损害。Schaaf等研究发现，OTA能提高原代大鼠肾近曲小管上皮细胞和猪肾近曲小管上皮细胞株活性氧簇的水平，并且这种效应呈剂量和时间依赖性，用活性氧簇探针2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酯（H2DCF-DA）检测到许多种氧自由基，包括超氧阴离子自由基和过氧化氢及羟基自由基。OTA所致的活性氧簇的增加先于对细胞增殖的抑制，这提示氧化应激是产生细胞毒性的原因而不是结果。同时研究发现细胞内还原型谷胱甘肽浓度大大降低，且在体外培养试验中发现OTA能导致8-羟基脱氧鸟嘌呤的生成。

（3）其他的作用机制 细胞间隙连接通讯（gap junctional intercellular communication，GJIC）可以协调不同组织、细胞间的代谢和电传导性，使各种信息有效地到达相应的细胞，保持细胞群体对生长刺激和调节反应的同步性，从而使细胞的增殖、分化按正常的程序进行，故GJIC在胚胎发育、细胞分化和生长控制等过程中起重要作用。许多正常动物细胞都有间隙连接和细胞间信号传导，而肿瘤细胞间的GJIC减弱或消失。在癌变过程中，GJIC的阻断可能使开始癌变的细胞摆脱其周围正常细胞信息（生长抑制因子或抑癌因子等）的调控而克隆化扩增、发展，从而形成肿瘤。除GJIC的改变外，肿瘤的细胞增殖过程还涉及对控制有丝分裂步骤的信号传导途径的诱导。研究发现OTA在非细胞毒性剂量时即能不可逆地抑制小鼠肝细胞的GJIC，并且OTA对细胞外信号调节激酶（ERK）和有丝分裂原活化蛋白激酶p38（p38MAPK）有较强的激活作用，但OTA却不是诱导细胞增殖，而是有很强的诱导细胞凋亡的作用，其作用机制还有待进一步研究。

3 危害

由于OTA可以直接污染谷类、水果等农作物，人和动物通过摄入污染的植物性食物而将其吸收入体内，同时OTA也可因在动物体内的蓄积作用而通过摄入动物性食物进入人体内。许多研究表明OTA的主要靶器官为肝和肾，用HPLC及ELISA检测也发现OTA进入雏鸡体内后广泛分布于各个器官，但以肝和肾居高，并有导致畸形、突变和致癌作用。为此，IARC将其定为Ⅱ（B）类致癌物。

（1）肾毒性 OTA被认为可能是巴尔干地方性肾病（Balkan endemic nephropathy，BEN）的主要致病因素之一，部分研究已经发现食物中OTA含量与BEN临床表现之间的相关性，但亦有研究未发现这种相关性。对欧洲一些OTA污染较严重的国家和地区人群的血清样品分析发现，健康人群血液中OTA的浓度为0.25～36nmol/L，而地方性肾病、肾盂癌、输尿管癌和膀胱癌患者血液中OTA的浓度则增至5～140nmol/L。短期试验结果显示，OTA对所有的单胃哺乳类动物均有肾毒性，可引起实验动物肾萎缩或肿大、颜色变灰白、皮质表面不平、断面可见皮质纤维性变；显微镜下可见肾小管萎缩、间质纤维化、肾小球透明变性、肾小管坏死等，并伴有尿量减少、血尿素氮升高、对氨基马尿酸清除率降低、尿频、尿蛋白和尿糖增加等肾功能损害的表现。

（2）肝毒性 在每千克饲料中加入0.3～1mgOTA，喂饲雏鸡后发现其肝糖原分解减少，并且肝内的肝糖原聚集与OTA有剂量-效应关系。郭延奎等对OTA中毒鸡的肝脏超微结构进行观察发现：肝小叶大小不一，小叶间结缔组织增厚，肝细胞的核膜增厚，线粒体肿胀溶解，内质网显著减少。细胞质内出现大量集结的糖原颗粒，还有许多大小不等的异物。肝细胞内出现大量自吞噬泡，次级溶酶体增多，有的肝细胞已被完全溶解。肝窦内星状细胞显著减少，并有大量红细胞，也可看到B淋巴细胞。肝组织中内皮细胞显著增生，填充于肝血窦之中，使肝窦空间变小。肝细胞的微绒毛减少，肝细胞之间的间隙亦变小。

（3）免疫毒性在研究OTA及其代谢物对人单核细胞/巨噬细胞系（TPH-1）的免疫毒性时发现，当OTA浓度在10～1000ng/mL时，TPH-1的代谢能力、细胞的增殖能力、细胞膜的完整性、细胞的分化、巨噬细胞的吞噬能力、氧化氮的合成及细胞表面标志物的形成均被抑制。而个别细胞系在OTA为1ng/mL时就出现了上述现象。给8～10周龄的瑞士小鼠每天腹腔注射5mg/kgOTA，连续50d，可抑制受试小鼠体内免疫球蛋白的合成，继而降低细胞介导的免疫应答，同时减少刀豆素A诱导的小鼠脾淋巴细胞的有丝分裂。

（4）对肿瘤发生的影响 给予80只F344大鼠（雌雄各半）21μg/kg、70μg/kg、210μg/kg剂量的OTA2年后发现，大鼠出现了肾小管增生性损伤、肾小管细胞腺瘤和肾小管细胞癌，并呈剂量-效应关系。其中高剂量组1只雄鼠在喂饲第9个月时出现肾小管细胞癌，在第15个月时所有雄鼠均出现了肾小管细胞腺瘤和肾小管细胞癌。在试验结束时3个剂量组所有的雌雄大鼠均出现了肾小管细腺肿瘤，尤以雄鼠的反应更为明显，高剂量组的雄鼠中大约有1/3肾小管细胞癌发展为转移性癌。虽然许多研究发现OTA的毒性及致癌性存在种属、性别和年龄的差异，但其机制尚不清楚。

4 国内外限量要求

基于OTA的潜在致癌性，WHO于1991年暂定谷物中OTA的限量标准为5μg/kg，并于1995年暂定每周允许摄入量为100ng/kg。CAC对小麦、大麦、黑麦等谷物及其产品中OTA限量为≤5.0μg/kg。欧盟（EU）对原粮中OTA的限量沿用了CAC的规定，对谷物产品中的OTA则进一步严格限量至≤3.0μg/kg。2005年1月1日欧盟在上述法规中增加了限量标准：葡萄酒、其他用于饮料制作的葡萄酒以及葡萄，2.0μg/kg；葡萄汁和其他饮料中的葡萄汁成分，2.0μg/kg。中国国家标准《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》对谷物、豆类中的OTA限量为≤5.0μg/kg。OTA的限量标准具体见表4-6。

5 样品前处理方法

5.1 毒素的提取

从食品和饲料中提取OTA一般选择毒性小、极性大、价格低廉的试剂。近年来世界各国相继创建了一系列从食品和农产品中提取OTA的方法，并针对食品基质的特性和OTA的性质发展了许多优化的复合提取系统，分述如下。

（1）固体食品基质中OTA的提取 从固体食品和饲料中提取OTA通常选用有机溶剂与酸性溶液（磷酸、乙酸或柠檬酸等）或碳酸氢钠溶液的混合提取系统，经典的提取溶剂系统是三氯甲烷-0.1mol/L磷酸（10:1，V/V）、二氯甲烷-乙醇-0.1mol/L磷酸（8:2:1，V/V）。由于OTA能溶于极性有机溶剂，因此通常将乙腈、氯仿作为提取溶剂，但它们的毒性较大，对环境和实验操作人员的危害较严重，因此多采用甲醇或复合提取溶剂，如乙腈-水、甲醇-水、甲醇-乙腈等。甲苯-2mol/L盐酸-0.42mol/L氯化镁（8:8:4，V/V）是提取小麦中OTA的首选溶剂；新鲜或烘烤咖啡豆中OTA的提取则常用甲醇-1%碳酸氢钠溶液。

（2）液体食品基质中OTA的提取 液体食品如啤酒、葡萄酒、奶、咖啡饮料中OTA提取的常用溶剂见表4-7。

（3）动物血液和组织中OTA的提取 分析动物血液和组织中OTA常用的提取溶剂是三氯甲烷与磷酸/盐酸、氯化镁/氯化钠（提高离子强度）的混合溶液或甲醇-水溶液（1:1，V/V），在pH2.5或更低的条件下提取，为分层充分，常需对提取后的溶液离心。为了降低血液和动物组织蛋白对试验结果的干扰，同时使与某些蛋白质结合的OTA有效释放出来以提高方法的回收率，常在提取溶剂系统中适当加入一些蛋白水解酶。如在50℃条件下将枯草杆菌蛋白酶A或木瓜蛋白酶加到pH9～10的甲醇-水（1:1，V/V）溶液中，通过透析方法提取猪肾脏中的OTA，其回收率是未加酶提取方法的2倍。Dietrich等的研究结果表明，牛奶经酶处理后上IAC柱，OTA的回收率高于未经酶处理的牛奶。

5.2 毒素的净化

对OTA提取液的净化方法有液-液萃取法、固相萃取法（硅胶柱、SPE和IAC柱等）。

5.2.1 液-液萃取法

液-液萃取法最早被用于样品预处理，它的基本原理是分配定律，即在一定温度下，溶质在两种不相溶的溶剂中分配时，平衡浓度之比为一常数。利用这一方法可把易溶于有机试剂的化合物直接萃取到与水不相溶的有机试剂中。液-液萃取法优点是方法简单，使用的仪器、试剂便宜，一般实验室都能完成。但该方法劳动强度大，程序不能实现自动化，且需使用大量的有机溶剂，易造成环境的污染和毒素的流失，毒素回收率不高。净化谷物中的OTA常用的液-液萃取法是先将OTA经溶剂分配，由氯仿中转移到稀碳酸氢钠或氢氧化钠溶液中，然后用浓盐酸调pH为2～3，使OTA回到原来弱酸的形式，再用二氯甲烷或氯仿提取。此方法较为经典，步骤较为简单，使用的化学试剂价格便宜，普通实验室的一般仪器均能操作，因此通常被采用。Monaci使用液-液萃取法净化猪肾、肌肉中的OTA，加标浓度为1g/kg时，回收率分别为（86±15）%和（74±8）%。

5.2.2 固相萃取法

常用于OTA净化的固相萃取柱主要有硅胶SPE柱、C1-SPE柱、氰基-固相萃取柱（CN-SPE柱）、氨基固相萃取柱（NH2-SPE柱）等。固相萃取柱通常用于样品分析前净化或富集。

用C18固相萃取柱净化时，将C18固相萃取小柱放于固相萃取富集装置和真空复制端口，用2mL甲醇、2mL水和3%碳酸氢钠分别活化，依次清洗每个柱子2次，弃去洗液。准确地将5mL碳酸氢盐提取液移入C18柱，加2mL0.1mol/L磷酸、2mL水，弃去洗液，用8mL乙酸乙酯-甲醇-乙酸（95:5:5，V/V）洗脱OTA于已入2mL水的10mL试管中。振摇或用玻璃棒搅拌使两相混合，吸出上层含OTA的提取液至10mL带螺旋盖的试管中，分别用1mL乙酸乙酯清洗试管壁和剩下上层液体2次，加入OTA中，在40℃水浴氮气下吹干洗脱液，用流动相溶液稀释残渣备用。

多功能柱净化技术使用一种特殊的固相萃取柱，它突破了传统的工作模式，柱中的密实固相填料不仅可以留住大分子化合物，更重要的是它含有几种活性亲脂性（非极性）、带电（极性）及离子交换等几类基团组成的填充剂，可吸附样液中的脂类、蛋白类、碳水化合物、糖类、叶黄质色素等各类杂质，待测组分OTA不被吸附而直接通过，从而一步完成净化过程，可以在30s内清除分析干扰物，减少了传统净化方式如免疫亲和色谱柱净化淋洗杂质和洗脱待测样的步骤，净化效果比较理想。这种净化手段适用于多种有机溶剂作为提取剂，与免疫亲和色谱柱层析净化互相补充，适合高脂肪样品的前处理，恰好弥补了免疫亲和色谱柱不能对抗原抗体结合反应有影响的样品基质进行纯化的缺陷，虽然净化效果达不到免疫亲和色谱柱的净化水平，但净化时间大大缩短、净化成本降低，扩宽了OTA的样品处理的技术手段，增加了OTA检测适用的样品范围。

薛斌等用离子交换固相萃取提取净化各类粮食中OTA，经高效液相色谱检测各类小麦、小麦粉、玉米、糙米和大豆中OTA回收率为83%～108%，总体平均回收率均在90%以上，平均RSD为3.54%～6.18%。空白样品检测结果也无显著杂质干扰，表明该法是一种有效、可靠、稳定的检测各

类粮食OTA的方法。Simon等使用MI（molecularly imprinted）固相柱萃取净化小麦提取液中的OTA，回收率为（103±3）%，检测下限为5.0μg/L。

Buttinger等使用Mycosep®229 Ochra柱净化小麦及葡萄干中的OTA，回收率分别为（87.9±12.5）%和（99.4±2.7）%；使用Multisep®229 Ochra柱净化大麦及葡萄干中的OTA，回收率分别为（76.5±8.0）%和（86.4±1.4）%。

免疫亲和柱净化法因具有快速、准确的特性，已经越来越被人们重视。它是利用真菌毒素特异性抗体制成的一种净化柱。样品提取液通过免疫亲和柱时，结合在固体支持物上的真菌毒素抗体将选择性地与真菌毒素结合，用水或缓冲溶液洗柱，洗掉大多数干扰物，再用少量的甲醇、乙腈或二甲基亚矾溶液洗柱，收集含真菌毒素的洗脱液，这时可根据不同需要纯化、浓缩及定量分析真菌毒素。单克隆抗体免疫亲和色谱柱净化法的优点是具有高度的特异性，能去除基质中绝大部分的杂质，对毒素净化的效果较好，回收率高，但是商品化的免疫亲和色谱柱主要以进口为主，价格昂贵。因此国内使用免疫亲和色谱柱做研究的相关报道较少，而国外研究报道较多。

Pena等使用单克隆免疫亲和色谱柱对OTA加标浓度为0.05μg/kg的大米样品进行分析，回收率为92%，检测下限为0.05μg/kg，RSD为5.4%。Fazekas等使用免疫亲和色谱柱净化法对匈牙利2001年的谷物、咖啡中的OTA进行调查，检测30份小麦饲料、32份玉米饲料、20份大麦饲料、50份咖啡，阳性率分别为26.7%、15.6%、35%、36%，OTA含量分别为0.3～62.8μg/kg、1.9～8.3μg/kg、0.14～212μg/kg、0.17～1.3μg/kg，检测下限为0.1μg/kg。

6 检测方法

6.1 薄层色谱法（TLC）

TLC是最早用于检测谷物中OTA的方法，样品经提取、浓缩、薄层分离后，根据OTA在333nm紫外灯下产生黄绿色荧光，在薄层板上显示荧光的最低检出量与标准溶液的荧光强度相比较来测定OTA含量。在检测谷物中的OTA时，横展和纵展相结合，常用的横展剂为乙醚、纵展剂为甲苯-乙酸乙酯-甲酸。用于动物组织中OTA的检测时常用苯-甲醇-醋酸（18:1:1，V/V）作为展开剂。

我国于1991年颁布了检测小麦、玉米和大豆中OTA的TLC国家标准检测方法，检测限为10μg/kg。Puntaric等使用TLC分析斯洛文尼亚南部城市斯拉沃尼亚布罗德（Slavonski Brod）周边地区的92份小麦和51份谷物中OTA，阳性率分别为75.8%和33.3%，OTA含量分别为0.02～160μg/kg和0.02～40μg/kg。

6.2 高效液相色谱法（HPLC）

HPLC是用于分析谷物、食品、咖啡、啤酒、葡萄酒、葡萄汁、牛奶、肾脏及其他肉类食品、人与动物组织液中OTA最广泛使用的一种方法。用C18柱净化样品抽提液中的OTA，目前常用的是反相C18柱，乙腈、甲醇或磷酸是最常用的流动相，并用梯度洗脱的方法，可以使OTA峰从干扰的基质中分离出来，用具有334mm的激发波长、464mm的发射波长的荧光检测器进行检测，根据峰高、峰面积、标准溶液浓度、进样体积、样品总体积计算出样品中OTA的浓度，这种方法的灵敏度达到0.005～0.1μg/kg（图4-9、图4-10）。

薛斌等研究建立了一种用C18固相萃取柱联用离子交换混合反相固相萃取柱的双柱固相萃取技术来提取、净化和富集浓缩花生和花生酱中OTA，再用高效液相色谱荧光检测器检测OTA的技术。花生中OTA的回收率在86.7%～107%，总体平均回收率为95.5%，平均RSD为5.3%；花生酱中OTA的回收率在77%～99.1%，总体平均回收率为87.1%，平均RSD为6.66%。色谱图如图4-11、图4-12所示。

Curto等采用HPLC检测了2000年生产的23份红、白葡萄酒中的OTA含量，并对OTA的含量与该酒的原料葡萄在种植过程中使用不同杀虫剂之间的关系进行了研究，结果表明，所有红葡萄酒均有OTA污染，且红葡萄酒比白葡萄酒污染OTA的频率高，检测下限为0.01μg/L。

Sibanda等建立了检测烘焙咖啡中OTA含量的HPLC，回收率为72%～84%，检测下限为1g/kg。

吕相征等建立了检测粮食中OTA含量的HPLC，并采用该方法检测了沈阳地区的35份小麦、27份水稻，结果有1份小麦样品为阳性，OTA含量为132.5μg/kg。该方法回收率大于80%，检测下限为0.5μg/kg。

陈大义等采用乙腈与体积分数1%的磷酸（99:1，V/V）提取粉碎后的样品，经过滤后取滤液，通过PSA固相萃取柱，洗脱后减压蒸干，用乙腈与水（4:6，V/V）溶解，进样量为20μL，用荧光检测器检测。该方法对大米、玉米、小麦、大麦等样品的回收率均在90%以上，最低检测限为0.05μg/kg，并能实现OTA和OTB的同时测定。

孙林超将免疫亲和色谱柱-高效液相色谱-荧光检测器相结合，测定白酒中OTA的含量，建立了测定白酒中OTA的方法，并进行了添加回收试验以及3浓度6重复的精密度试验。该方法用2%碳酸氢钠和15%氯化钠的水溶液对白酒中OTA进行提取，然后通过OchraTest免疫亲和色谱柱净化，采用安捷伦（Agilent）公司的C18柱（4.6mm×300mm，5μm），流动相为乙腈-水-乙酸（50:49:1，V/V），流速0.80mL/min。激发波长335nm、发射波长465nm。柱温30℃，进样量20μL。结果表明，OTA在1.0×10－9～10×10－9g/mL时，浓度与峰面积呈线性关系（r＝0.9981）。加标回收率为93.33%～97.40%，最低检出限为0.12×10－9g/mL。RSD分别为2.16%、3.13%和5.19%。

朱孟丽研究了用高效液相色谱法测定饲料原料和配合饲料中OT的方法。样品经乙腈-水（84:16，V/V）提取，提取液通过Mycosep®229柱净化、浓缩，C18色谱柱分离，用荧光检测器检测，外标法定量，对添加2个浓度OT的玉米样品进行加标回收试验，平均回收率为99.12%和103.09%，变异系数分别为0.281%、1.214%，最低检测限为20ng/kg。

谈敦芳等利用液-液分离前处理技术，选用C18反相柱（250mm×4.6mm），以乙腈-水-乙酸（99:99:2，V/V）为流动相，流速1mL/min，荧光检测器（激发波长333nm、发射波长460nm）定量，柱温25℃。结果：以准确度和精密度评价该方法，其中变异系数均低于10%，回收率为77.61%～95.66%。

6.3 液相色谱-质谱联用（LC-MS）

Reinsch等建立了啤酒中OTA的检测方法，采用阴离子交换/反相提纯法和LC-MS，在OTA含量为1.7～5.6μg/kg时取得了令人满意的结果。检测限和定量限分别达到了0.4μg/kg和0.8μg/kg。

阎龙宝等建立了葡萄酒中OTA的高效液相色谱-串联四极杆质谱联用测定方法。该方法经HLB固相萃取柱净化样品，以ZORBAX Eclipse XDB- C18柱（3.0mm×50mm，1.8μm）分离，流动相为0.1%甲酸水溶液和甲醇（梯度洗脱），电喷雾正离子MRM模式检测。该方法的检出限为0.20μg/L，方法定量下限为0.20μg/L，线性范围0.2～100μg/L，加标回收率86.6%～91.0%，RSD为1.67%（图4-13，图4-14）。

6.4 免疫学方法

免疫学方法是以抗原抗体免疫学反应为基础进行抗原抗体含量测定的方法，具有高度特异性、灵敏性和快速简便等优点。用于OTA检测的免疫学方法主要有ELISA、胶体金免疫层析法（GICA）、免疫亲和柱-荧光光度法、免疫亲和色谱柱-高效液相色谱法（IAC-HPLC）、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）和免疫传感器法等。

OTA是典型的半抗原，需与大分子物质结合形成人工抗原后才有免疫原性，免疫时采用OTA-BSA人工抗原，产生的抗体要通过固相抗原筛选。由于OTA是小分子化合物，难以直接吸附到酶标板上，因此筛选时需制备另一种人工抗原。OTA中的羧基为活性基团，可与蛋白质的氨基结合，因此可用碳二亚胺法，使OTA与大分子钥孔血蓝蛋白（KLH）结合，以合成的OTA-KLH作为固相筛选抗原。

OTA-KLH抗原的制备步骤如下：用1mL二甲基甲酰胺（DMF）溶解1mg OTA；用1mL的0.1mol/L PBS pH7.0缓冲液溶解1mg KLH载体蛋白。取0.5mL OTA的溶液加到KLH的溶液中；溶解2mg碳二亚胺于1mL双蒸水中，并取50μL加入上述混合液中，室温反应2h后离心，取上清液用Sephadex G-25分离，第一个洗脱峰合并后进行紫外扫描检测，合格后分装备用（图4-15）。

抗OTA单克隆抗体的制备：用OTA-BSA人工抗原免疫Balb/c小鼠，首次用OTA-BSA与福氏完全佐剂混匀后于每只小鼠皮下和腹腔注射0.1mg，以后每隔2周将OTA-BSA与福氏不完全佐剂混匀后再免疫4次，待产生抗体后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，融合剂为50%聚乙二醇，加HAT（含胎牛血清）选择性培养液于37℃二氧化碳培养箱中培养。酶标板包被OTA-KLH形成筛选用抗原，用间接ELISA筛选阳性克隆。筛选到的阳性克隆再用有限稀释法克隆化、建立分泌高专一性抗OTA的杂交瘤细胞株，并将杂交瘤细胞注射到以降植烷敏化的Balb/c小鼠腹腔中，10d后取腹水，分装后于－20℃存放备用。

6.4.1 ELISA

该方法结合了抗原抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化显色反应。首先将OTA牛血清白蛋白连接物包被酶标微孔板，加入含不同浓度的OTA标准品或样品提取液与单克隆抗体的混合液，再加入酶标记的抗体，进行竞争免疫反应，最后加入底物溶液，然后根据OTA标准样品孔和样品孔的显色情况用目测或用仪器测量来确定样品中OTA的量（图4-16，图4-17，图4-18）。

江涛等建立了OTA的间接竞争抑制性ELISA，在2～500μg/kg线性范围内，回收率为79%～119.7%，检测下限为0.5μg/kg，并采用该方法检测了北京市售的28份大米、28份小麦，阳性率分别为17.86%和60.71%，OTA最高含量分别为3.44μg/kg和8.26μg/kg。

Zheng等使用AgraQuant®-ELISA试剂盒对零售的高粱、大麦、新鲜咖啡豆、小麦、大豆和玉米进行检测，OTA含量分别为2.9μg/kg、2.2μg/kg、2.8μg/kg、2.2μg/kg、1.5μg/kg、0.6μg/kg。同时使用HPLC对其检测值进行比较，结果两种方法检测值相一致。

刘仁荣等建立单克隆抗体竞争ELISA，线性范围为0.2～6μg/L，检测下限为0.15μg/L，单克隆抗体与OTB交叉反应率为35%，与橘霉素、AFB1和展青霉素等毒素交叉反应率低于0.01%，在小麦样品中加标回收率为83%～116%，变异系数为9.4%～19.8%。

时瑾等针对ELISA检测OTA进行了改进研究，研究表明使用微量振荡酶标板可以缩短免疫反应监测时间约30min。采用ELISA测小麦样品中的OTA时，使用空白样品提取液来配制OTA标准溶液可以消除样品基质造成的干扰。同时对提取溶剂加以改进（见图4-19、表4-8），采用氯化钠-水-甲醇（0.1:70:30，V/V）作为提取溶剂的提取效率最高。0.1μg/kg、1μg/kg、10μg/kg3个浓度水平的加标回收率为95%～110%，方法重复性良好，变异系数小于10%。

6.4.2 时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）

TRFIA是超微量检测中一项新兴的检测技术，是将免疫反应的高度特异性和标记示踪的高度灵敏性相结合而建立的一类微量物质检测技术。TRFIA和通常的免疫分析原理基本相同，只是采用了三价稀土离子作为标记物，抗原抗体免疫反应发生后，用时间分辨荧光测定最后产物中的荧光浓度，根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。

黄飚等采用稀土离子标记技术，应用多克隆抗体建立高灵敏的OTA-时间分辨荧光免疫分析（OTA-TRFIA）。以OTA-KLH为免疫原制备抗OTA抗体；以OTA与BSA的联结物（OTA-BSA）为固相抗原，与游离OTA共同竞争有限的兔抗OTA抗体；用三价铕离子（Eu3＋）标记的羊抗兔抗体。该方法的灵敏度为0.02μg/L，测量范围为0.02～400μg/L，批内和批间变异系数分别为2.6%和5.2%，平均回收率为95.8%，与OTB对OTA的检测有5.6%的交叉反应，而AFBl及BSA则没有交叉反应。抑制率为0浓度点的20%、50%、80%时对应的浓度（ED20、ED50、ED80）分别为0.2μg/L、1.0μg/L和5.3μg/L。不同包被浓度OTA-TRIFA的抑制曲线如图4-20所示。

6.4.3 胶体金免疫层析法（GICA）

胶体金免疫层析法是在单克隆抗体技术、免疫胶体金技术和新材料技术基础上发展起来的一项以膜为固相载体的快速检测技术。胶体金免疫层析具有快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好、操作简便、无须任何仪器设备、结果判断直观可靠、经济实用的特点，容易被基层掌握并大面积推广，适应我国当前社会经济技术水平，可在食品安全领域发挥积极作用。

OTA快速检测试纸条利用的是抗原抗体特异性结合的原理。试纸条中含有底板和试剂吸附层底。板为不吸水薄片层，试剂吸附层固定在底板上，从加样处开始分别为样品垫、胶金垫、NC膜和吸水纸。在胶金垫上喷有金标抗体，在NC膜上喷有偶联了BSA的OTA（检测线）和驴抗鼠的二抗（控制线），在控制线出现红线的前提下，根据检测线是否出现红色进行判断。样品中的OTA在流动过程中与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和NC膜检测线上OTA卵白蛋白（OVA）偶联物的结合，如果样品中OTA含量大于10ng/mL，检测线不显颜色，结果为阳性；反之，检测线显红色结果为阴性。如果控制线不出现红色，则说明整个试纸条失效。

OTA快速检测试纸条应用了竞争抑制免疫层析的方法，整个过程只需一步加样，10min内就能判定结果而且具有稳定性好、灵敏度高、结果准确、易于判定、经济实用等优点，非常适合于大批量样品的现场快速检测，容易被基层掌握并大面积推广，适应我国经济技术发展状况。

赖卫华等在传统胶体金试纸条的基础上研制了OTA无毒体系的胶体金试纸条，其与传统胶体金试纸条的不同之处在于其在检测限上喷的为OTA替代品———模拟表位肽的OTA。结果表明，该种试纸条具有良好的性能指标。检测灵敏度为10ng/mL，检测时间为10min，OTA浓度为0～10000ng/mL时有效，在5℃、20℃、35℃下用OTA无毒体系快速检测试纸条检测样品，检测结果一致（图4-21）。常温下OTA无毒体系快速检测试纸条的保质期为14个月，具有较好的特异性，完全可以替代传统的OTA试纸条。

6.4.4 免疫亲和色谱柱-荧光光度法

免疫亲和色谱柱-荧光光度法是将免疫亲和色谱柱净化与荧光光度测定相结合的一种分析OTA的方法。褚庆华等用此法对谷物和酒类中OTA进行测定，在1～50μg/kg范围内加标回收率为60.3%～1189%。还建立食用植物油OTA快速筛选方法（荧光光度法）和确证方法（HPLC），在1～50μg/kg添加范围内回收率为64.7%～120%。免疫亲和柱Ｇ荧光光度法用于OTA检测，克服TLC和HPLC在操作过程中使用有毒OTA作为标定标准物和在样品预处理过程中使用多种有毒、异味有机溶剂，毒害操作人员和污染环境缺点，仪器设备轻便容易携带、自动化程度高、操作简单、可直接读出测试结果，可在小实验或现场使用；但精确定量效果较差，适于OTA快速筛选之用。

鉴于OTA的毒性及在食品中的广泛污染，世界各国相继创建或正在改迸检测该毒素的方法（表4-9），而方法的检测限和回收率是评价一种分析方法优劣的重要指标。理想的分析方法应该是简单、快速、准确、有效、灵敏、特异、经济、节省人力物力等。随着待测食品种类的扩大和食品基质成分的复杂化，来自食品中非测定成分的干扰越来越多，因此对试样净化、检测手段的要求越高。发展廉价、灵敏、特异、快速的净化手段和检测方法，以此为技术支撑制定限量标准以降低人群暴露是今后的研究方向。

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