原代细胞培养纯度多少可以做实验（关于10D细胞培养的介绍）

「链接」细胞培养包括在人工环境中培养细胞，以研究它们对环境的反应行为。现在可以找到不同种类的细胞培养物，根据其性质和应用，其中一些会比另一些更适合。其中，与其他替代细胞培养方法相比，3D细胞培养因其新的、方便的特点而越来越多地被使用。3D细胞培养可以被描述为在微组装设备和载体中培养活细胞，呈现出模仿组织和器官特定微结构的三维结构。

扫描电子显微镜二维细胞培养图像

1. 培养方法：2D VS 3D

1.1.2D培养速览

在过去的几十年里，2D培养传统上不仅被用于研究不同类型的体外细胞，还被用于进行药物筛选和测试。通常，这种单层系统允许细胞在聚酯或玻璃平面上生长，为不断增长的细胞群提供了一种介质。由于2D细胞培养，出现了无数的生物学突破。然而，由于其简单性，该模型不能准确地描述和模拟体内观察到的丰富的环境和复杂的过程，如细胞信号、化学或几何。因此，用2D细胞培养方法收集的数据对于体内应用可能是误导和不可预测的。这就是为什么科学家们最近一直在研究三维仿生细胞培养，这项技术更准确地代表了细胞在体内茁壮成长的实际微环境。

1.2.3D细胞培养：比较3D细胞培养与2D细胞培养的优缺点

你可能已经知道，3D细胞培养有不同的类型，每一种都有不同的优点和缺点。与2D细胞培养不同，3D细胞培养通过使用微组装结构和复杂的环境参数来促进细胞分化和组织形成。事实上，与在2D环境中生长的细胞相反，在3D环境中，细胞往往更容易受到形态和生理变化的影响。这主要可以通过指导细胞行为的支架的结构作用和影响来解释。研究人员发现，这种细胞载体的几何形状和组成不仅可以影响基因的表达，还可以增强细胞间的沟通。例如，一些促进细胞增殖的基因在3D细胞培养中被抑制，从而避免了2D细胞培养中遇到的无政府增殖。3D细胞培养还提供了同时培养两个不同细胞群体的可能性，与基于2D细胞培养的共培养不同，共培养准确地复制了组织内观察到的细胞功能。

感兴趣的细胞与其他细胞之间的相互作用显然是细胞功能的关键要素。这就是为什么对基质细胞(器官结缔组织)进行研究的原因，基质细胞在癌症中发挥重要作用。最后，使用3D细胞培养可以更容易地控制和监测生长细胞的微环境参数(温度、化学梯度、氧气速率、pH等)。在一定程度上，同时尽可能接近现实，这要归功于微工程(微流体)。

3D细胞培养产生的新生视网膜

人们必须记住，3D细胞培养是一项相对较新的技术，研究人员尚未完全掌握其潜在的现象和含义。不幸的是，这种培养方法带来了一些明显的缺点，很可能被技术进步所克服。首先，一些支架基质含有来自动物或其他有害来源(病毒、可溶性因子)的化合物，可能会干扰细胞培养。其他一些基质提供了良好的细胞粘附性，使得去除细胞变得更加困难。此外，虽然3D细胞培养可能是一种节省成本的技术，可以跳过药物试验中的动物药物测试步骤，但开发自动化和可重复应用仍然是一个非常昂贵和细致的过程。

【与2D单层细胞培养不同，3D细胞培养是模拟体内细胞行为和组织(形态和生理)的更令人满意的模型。组装多层三维细胞结构只能通过使用支架来实现，支架是一种微组织的细胞载体，对细胞的分化和增殖有很大影响。由于它的新颖性，这项技术还没有完全被理解，因此不容易掌握。最后，为改进3D细胞培养而进行的应用程序开发可能代价高昂。】

2.3D培养中的支架类型

【支架是3D细胞培养中的关键支撑元素，根据条件和预期的目标，目前有不同类型的支架可供选择。】

2.1.基于支架的3D培养技术

如上所述，支架可以为3D细胞培养提供方便的支撑。由于其多孔性，支架有助于氧气、营养物质和废物的运输。因此，细胞可以在支架网内增殖和迁移，最终附着在支架网上。随着它们的不断生长，成熟的细胞最终会相互作用，最终会变成与它们最初起源的组织接近的结构。大多数情况下，这些聚集体呈现为不同大小的球体，称为球体：这种细胞结构通常用于药物筛选和任何其他3D细胞培养应用。最后，使用支架的3D细胞培养提供了更大的表面，通常比那些不依赖这种支架的细胞培养更大。

随机组织的脚手架结构的示例

2.1.3其他类型的脚手架

如前所述，除了水凝胶，还有一些其他类型的支架可以找到，尽管绝大多数都是作为组织工程支架使用的。其中一种材料，生物玻璃或生物陶瓷，是一种可生物吸收的材料，可以提高新生组织的再生活性。另一方面，由于金属具有较高的抗压强度，尤其是优异的抗疲劳性，设计了主要由钛(Ti)和钽(Ta)制成的多孔金属支架。常用的非凝胶聚合物支架是用于组织工程的天然聚合物，如胶原、纤维蛋白、海藻酸盐、丝绸、透明质酸和壳聚糖。合成聚合物有聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)和聚己内酯(PCL)。这些聚合物被优先使用，因为它们产生的单体在植入时很容易被自然生理途径移除。最后，复合材料也用于搭建脚手架。它们由两种或两种以上截然不同的材料(例如陶瓷和聚合物的组合)组成，以利用这两种材料的性能来满足机械和生理要求。

一种复合支架的制备工艺及微观观察

2.2.无支架三维细胞培养技术

为了产生球体，细胞聚集体作为良好的生理模型，也可以制作不依赖固体支持(ECM分子或生物材料)的3D培养。使用这种技术获得的球体大多更小，阻力更小。无支架三维细胞培养技术主要有强制漂浮法、悬滴法和搅拌法。无脚手架技术包括使用低附着力聚合物涂层井板的强制漂浮法。球体是在离心后用细胞悬浮液填充这些孔板而产生的。

悬滴法是Kelm等人采用的一种无支架技术，包括将细胞悬浮液等量放置在微孔微型托盘(Nunc)内。通过反转盘子(托盘)，等分变成液滴，在其尖端呈现细胞聚集体，从而形成致密而均匀的球体。最后但并非最不重要的是，使用生物反应器的基于搅拌的方法也可以是获得三维球体的一种简单的替代方法。放置在旋转生物反应器中的细胞悬浮液逐渐将分离的细胞转变为聚集体，由于持续的搅拌，这些聚集体无法附着在容器壁上。结果，最终产生了范围广泛的非均匀椭球体。

无支架三维细胞培养技术

【支架是调节细胞生长和增强信号的多孔性支撑物。为了达到这一目的，它们促进了氧气、营养物质、可溶性因子和废物的运输，这要归功于它们旨在模拟体内组织结构的独特结构。目前制作的支架是膜、基质，最重要的是具有优异性能的水凝胶。用于组织工程的支架不同于那些在3D细胞培养中发现的支架，因为它具有独特的特征，如生物降解性。最后，还可以使用无支架3D细胞培养技术来获得球体：强制漂浮法、悬滴法和搅拌法。】

3.3D培养中的细胞特性

【无论它们来自哪里，在3D细胞培养中生长的细胞都会呈现出特殊的外观，这取决于它们要模拟的组织。它们呈现不同的属性和交互作用，如下所述。】

3.1.3D培养：细胞大体形态

与2D细胞培养呈现单层结构相反，三维方法产生多层细胞聚集体(球体)，呈现类似于体内观察到的复杂组织结构。正如上一部分所解释的，这一壮举主要是由于支架的构建作用，使细胞能够获得这样的组织样组织。最后，总体外观最终将取决于细胞类型，因为在3D培养中生长的上皮组织往往会形成极化的薄片，就像皮肤表皮一样。

3.2.3D培养：细胞间的相互作用

细胞与细胞和细胞与基质的相互作用都是3D细胞培养中需要考虑的关键参数。通过直接接触或化学作用，细胞可以相互作用并协同作用，以实现特定的目的。

首先，通信是通过细胞连接实现的，细胞连接是由蛋白质组成的直接细胞间通道，形成了连接一个细胞与其邻居(或一个细胞与基质)的通道。此外，细胞因子或生长因子等分泌的可溶性因子通过直接接触或流动输送到邻近细胞和细胞外基质，产生由分子寿命决定的梯度。这些因子最终会与任何其他细胞(或用于自动调节的同一细胞)表达的受体结合，从而触发生理反应。此外，流向ECM的分子将由载体储存，并在需要时释放

细胞-细胞和细胞-基质相互作用

此外，细胞还可以蓬勃发展，这要归功于分化和生理功能所必需的细胞与基质的相互作用(为了更好地表达生物标志物和受体)。这种相互作用是至关重要的，因为生长细胞获得的一些特性只能通过支架对基因表达的影响及其对整个组织组织的支持作用来获得

3.3用于3D细胞培养的细胞的来源和性质

广泛的细胞类型可以被取样作为底物，以在3D培养中产生球体。至于组织工程，大多数时候需要特定类型的细胞群，如干细胞、自体细胞、同种异体细胞、异种细胞、祖细胞和多能细胞。同样，3D培养使用这些细胞来获得球体。此外，这种培养方法还包括这些细胞类型的转基因变体，还包括细胞系或动物来源的原代细胞

人骨髓间充质干细胞与纤维蛋白的黏附

由于担心免疫排斥，科学家们更喜欢使用自体或充其量是同种异体的细胞，尽管它们并不是没有缺陷。事实上，在处理所有上述类型的细胞时，人们应该记住，低可获得性(3D培养中大多数细胞类型的常见问题)、在体外增殖能力方面遇到的困难或缺乏临床应用可能是主要的不利因素。然而，与其他类型的细胞不同，祖细胞和多潜能细胞显示出有希望的结果，因为没有受到前面提到的所有限制的负担。事实上，它们区分不同血统的能力是许多科学家深入研究的一个令人震惊的属性。研究人员正竭力在体外控制这一过程，因为干细胞在体内和体外的生长存在巨大差异。干细胞可以被诱导为体内分化的多能干细胞(IPS)。它们也可以从胰腺、心血管系统、脑、肺、肝、脂肪组织和骨髓等大量组织中分离出来。

【在3D细胞培养中生长的细胞可以是干细胞、自体细胞、同种异体细胞、异种细胞、祖细胞和多潜能细胞。它们形成称为球体的多层聚集体，显示出类似组织的组织，由于它们在结构上接近体内器官组织，因此在许多应用中被使用。最后，通过细胞连接和可溶性因子，可以观察到细胞或基质之间的直接和间接相互作用。】

4.3D细胞培养应用

【作为一种研究细胞在反映活体条件的环境中行为的工具，3D细胞培养提供了许多应用。以下是一些最著名和最有用的可用方法。】

4.1.组织工程中的三维细胞培养

对于普通或个别患者，3D细胞培养最近已成为组织工程领域的重大突破。事实上，3D细胞培养提供了解决组织修复的替代方法，组织再生和重建可能大大受益于3D细胞培养。

事实上，代替使用生物材料，可以在3D培养中使用微结构纤维支架(例如用于皮肤重建的上皮真皮)来生成人体组织。不幸的是，组织工程可能非常昂贵，而且一些国家对这一应用的监管没有很好的定义。尽管如此，3D培养仍然是进行干细胞和细胞分化研究的可靠方法。了解错综复杂的机制，如成骨细胞如何转变为骨细胞，现在是可能的，而且是可重复的。在这种情况下，成骨可以通过干细胞表达I型胶原标记物(CBFA-1、碱性磷酸酶、骨联素、骨桥蛋白和JNK2)来触发。因此，生产出的具有所需特性的细胞可以被注射到骨骼病变内，以重建受损组织。

4.2.微流控三维细胞培养：器官芯片

随着能够精确控制微环境参数的微流控技术的发展，利用生物兼容的微流控芯片建立了长期可控的3D细胞培养模型，方便了组织的操作和研究。这些芯片上的器官是仿生系统，通过模仿器官的微观结构、动态机械特性和生化功能来复制活器官的关键功能。器官芯片通过改进现有的方法和带来新的可能性，改变了3D细胞培养的方式：

为了更好地复制活组织的组织和功能，由胶原蛋白或聚合物基膜制成的微结构被构建在芯片微通道内。与传统的3D细胞培养不同，这些结构实际上可以重建在体内观察到的功能。例如，人类呼吸的肺器官芯片就是肺泡毛细血管的模型。它集成了一层柔性聚合物膜，可以像在活人肺内一样运动。

呼吸中的肺器官芯片

微流控技术使芯片上的器官能够在不同的尺度上进行精确的流动控制，以“灌溉”细胞培养。因此，通过为细胞带来必要的营养和其他元素来创造时空梯度是可能的。器官芯片还可以促进创建分隔的微流控系统，从而实现受控共培养并重建组织-组织界面。因此，可以发展许多疾病模型：例如，在恶性乳腺肿瘤和脑肿瘤的情况下，不同组织类型之间的沟通，或者当乳腺癌细胞成为浸润性癌时的行为。这项新技术完美地满足了挑剔和复杂的3D细胞培养要求。事实上，它有助于模拟组织界面以模拟器官功能，同时彻底监控和调节微环境(化学信号、流体流动、机械现象)。作为三维细胞培养的宿主，微通道连接到流经其中的流体混合的孔。

这些通道由微流控输出设备(流量测量和控制系统)精确控制，这些设备调节微环境中的流量。通过使用微流控芯片，微通道内的受控细胞生长由提供足够的机械、化学和表面特性的适当载体引导。归根结底，通过芯片上的器官获得的结果是组织良好的组织，更能代表体内器官结构及其过程。由于这种节省时间的仿生模型，药物开发研究很容易进行，以便在器官尺度或系统尺度(芯片上的多个器官)上研究人类的生理反应。

4.3.3D细胞培养在药物检测中的应用

药物发现研究通常使用动物模型进行，已有30多年的历史[46]。起初，这种做法在制药行业是一项可管理的例行任务。然而，随着时间的推移，可用的药物分子越多，高通量药物筛选就变得越昂贵，进行这些测试所需的时间也就越长。伴随着这一现象，引发了关于动物药物测试的伦理争议，这些测试甚至没有很好地转化为人类应用。从那时起，3D培养通过提供与2D或动物细胞培养非常相似的体内反应在一定程度上解决了这些问题。事实上，一些研究表明，在3D培养中生长的细胞对药物治疗的抵抗力更强，而使用其他培养方法则显示出有希望的结果。

因此，3D细胞培养也可以被描述为一种用于药物筛选的成本效益/节省时间的培养技术，因为它极大地缩短了药物试验周期，同时使药物试验更精确或更有针对性。例如，使用微工程应用(芯片上的器官)，癌症治疗正在变得更好，通过更精确地针对特定细胞类型、明确的生物机制、精确的受体等来改善收益-风险平衡。不幸的是，仍然有太多药物测试由于无法提供无进展生存而不断失败。事实上，尽管3D细胞培养产生的组织与实际的自然组织之间可能更接近活体，但仍存在差距。

【3D细胞培养呈现了许多有趣的应用。其中，组织工程学专门通过注入3D细胞培养产生的新组织来修复受损组织。这种培养方法试图尽可能地缩小体外和体内药物测试模型之间的差距。因此，有越来越多的靶向癌症治疗方法可用。芯片器官和微流控等微工程应用极大地促进了药物检测过程的改进。它们提供了对3D细胞培养微环境的精确控制，并允许比以前更精确和更容易地研究器官生理学。】

关于3D细胞培养的结论

细胞在三维环境中自然生长、成熟和分化。使用3D培养是在体外重现这一过程的准确方法。这就是为什么科学家们一直在研究广泛的细胞类型，包括干细胞、自体细胞、同种细胞、异种细胞、祖细胞和多能细胞。与2D单层细胞培养不同，3D细胞培养模型几乎可以完美地模拟体内细胞的行为和组织(形态和生理)。可以通过使用脚手架或无脚手架的方法来组装多层3D单元结构。无论是否使用支架，由于细胞连接和可溶性因子的作用，构成球体的细胞可以通过直接和间接的相互作用在自身和基质/载体之间相互作用。如今，组织工程等许多应用都源于3D细胞培养，这也得益于微流控芯片器官的出现，这也有助于改进药物测试。然而，随着3D细胞培养的科学家们仍在努力掌握其中的诀窍。

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