动物免疫血清如何制备（动物血液凝集反应）

习惯上把体内的抗原抗体反应称为免疫反应，体外的抗原抗体反应因为主要依靠于存在于血清中的抗体来进行，所以称为血清学反应。

一 血清学反应的特点

抗原抗体反应具有比较严格的特异性。例如布氏杆菌的抗原只能与布氏杆菌的抗体发生反应；破伤风毒素只能与破伤风抗毒素反应等。

合适的比例。一定量的抗原只能与一定量的抗体结合才出现可见反应。一般认为抗原分子是多价的，可以结合多个抗体分子（一般可结合3~6个抗体分子），而抗体分子是双价的，可与两个抗原分子结合，只有两者比例合适，才能构成较大的集团，发生可见的凝集或沉淀反应。

可逆性。抗原抗体结合是表面分子的结合，具有相对稳定性。在某种情况下，能出现可逆反应。例如毒素和抗毒素结合后仍可将其完整的分离开，并不影响毒素的毒性。

二 试验方法

（一）直接凝集反应（细菌凝集反应）

有玻片法和试管法两种。玻片法是将已知的免疫血清（或待检血清）与未知的抗原（或已知的抗原）各一滴，在玻片上混合，晃动玻片1~2分钟，出现可见的凝集现象者为阳性反应。在兽医实践工作中，常用于传染病的诊断，如布氏杆菌病及鸡白痢等。此外，还可用于各型沙门氏杆菌的定性。试管法通常用已知抗原检查待检血清中相应抗体的有无及其含量（凝集价）。在一系列试管中，将被检血清用生理盐水作倍比稀释，各加入等量已知抗原，以最高稀释度仍有明显凝集现象者为该被检血清的效价。本法也常用于布氏杆菌及马副伤寒等病的诊断。

（二）间接凝集反应

可溶性抗原与其相应的抗体不能发生肉眼可见的凝集反应，若将其吸附在颗粒性物体表面（称为致敏）再与相应抗体结合，便可出现可见的凝集现象，称为间接凝集反应。若用红细胞作为载体，便称为间接血细胞凝集试验（简称间接血凝）。本法敏感性极高，能测出极微量的抗体，兽医工作中常用来检查炭疽杆菌病、钩端螺旋体病等多种畜禽传染病的诊断和鉴定菌型的工作中。

1、红细胞悬浮液的准备

无菌采取绵羊脱纤维血，用pH值7.2磷酸盐缓冲液洗涤3次，制成3%红细胞悬浮液。为了提高红细胞同抗原的结合能力，在敏化前先经鞣酸处理或在致敏时加入重偶氮联苯胺。为了延长致敏红细胞的保存时间，可在敏化之前或之后做醛化处理。

(1)醛化处理 红细胞悬浮液100ml，加甲醛溶液40ml，置37℃℃水浴中90分钟至2小时，取出用生理盐水洗涤3~4次，最后制成3%红细胞悬浮液，。

(2) 鞣酸化处理 红细胞悬浮液加等量的鞣酸生理盐水溶液（1:30000），置37℃水浴中15分钟，取出用生理盐水洗涤2~3次，最后制成3%红细胞悬浮液。

2、红细胞敏化

取抗原与3%红细胞悬浮液（经醛化和鞣化处理）等量混合，置37℃水浴中15分钟，取出用磷酸缓冲液（加有1%兔血清，pH值7.2）洗涤3次，最后制成3%红细胞悬浮液，即为致敏红细胞液。

3、被检血清

以常法获得血清，以生理盐水做1:5稀释，在56℃水浴中灭活30分钟。

4、操作方法

取有凹孔的塑料板一块（亦可用小试管）按规定将不同稀释度的被检血清加入各凹孔中，每孔加入已致敏的红细胞悬浮液一滴，混匀，置37℃温箱中1~2小时，后观察结果。

5、判定结果

红细胞在孔底形成不规则的网状凝集物为阳性反应。红细胞沉降于孔底呈圆点状，无凝集现象为阴性反应。

（三） 病毒的血细胞凝集和血细胞凝集抑制试验

有些病毒（如流感病毒、鸡新城疫病毒）与动物红细胞混悬液混合后能使红细胞发生凝集，但这种凝集作用可为相应的抗体所抑制。因此，可以用已知的免疫血清（抗体）鉴定未知的病毒(抗原）。反之，亦可以用已知的病毒（抗原）来检查病畜血清中的抗体和抗体的抑制价。前者称为血细胞凝集试验，后者称为血细胞凝集抑制试验。兽医工作中常用于诊断鸡新城疫等病。

三、影响凝集反应的因素

1、电解质 凝集反应必须有适量电解质参加。实验中常用生理盐水来稀释血液或细菌悬液，但过多的盐分能产生“盐凝集”（氰化钠增到一定浓度时，即使血液没有抗体，亦能使细菌悬液发生凝集）。

2、酸碱度 凝集反应以在pH值6~8的环境中进行最合适，若偏酸性，达到了细菌蛋白的等电点（pH值4.3左右）时，即或在无相应抗体存在的情况下，细菌亦能发生凝集现象，称为“酸凝集”。

3、温度 不同的凝集反应对温度的要求亦不相同，有的在4℃，有的在室温，有的在37℃下进行反应。一般情况下，温度从0~30℃凝集反应的速度随温度的升高而迅速增加，增高温度可促进抗原颗粒的分子运动，使抗原抗体的分子互相撞击粘着的机会增多，因而加速凝集块的形成。

4、振荡 混合物的振荡可增加抗原抗体分子间的撞击，加快反应速度。

5、抗原和抗体的比例 在凝集反应中，抗原抗体的比例最适当时，反应出现最好。抗体浓度过高时反而不出现凝集，这种现象称为前带现象。

作者：毕长红 兽医师