隔离对物种形成的作用（浙江万里学院葛楚天等深层次揭示温度对于物种性别的控制机制）

在许多爬行动物中，包括红耳龟（T. scripta），性别取决于胚胎发生过程中的环境温度。先前研究显示，表观遗传调节因子Kdm6b在雄性产生温度下升高，并且对于激活雄性途径至关重要。

2020年4月17日，浙江万里学院浙江万里学院葛楚天，钱国英及杜克大学Blanche Capel等人在Science 在线发表题为“Temperature-dependent sex determination is mediated by pSTAT3 repression of Kdm6b”的研究论文，该研究建立了温度与Kdm6b转录调控之间的因果关系。该研究显示，信号转导和转录激活因子3（STAT3）在温暖的雌性产生温度下被磷酸化，与Kdm6b基因座结合，并抑制Kdm6b转录，从而阻断了雄性途径。Ca2 的流入（STAT3磷酸化的介体）在雌性温度下升高，并充当STAT3激活的温度敏感调节剂。

另外，2018年5月11日，浙江万里学院浙江万里学院葛楚天，钱国英及杜克大学Blanche Capel等人在Science 在线发表题为“The histone demethylase KDM6B regulates temperature- dependent sex determination in a turtle species”的研究论文，该研究发现组蛋白H3第27位赖氨酸(H3K27)去甲基化酶KDM6B在红耳龟未分化性腺中呈现温度依赖型二态性表达分布，并且温度置换实验显示，在性腺分化前，Kdm6b能快速响应温度变化。令人惊奇的是，通过RNA干扰将产雄温度（male-producing temperature, MPT）胚胎Kdm6b敲低后发现，80-87%的MPT胚胎出现雄性向雌性性逆转。另外还发现，KDM6B通过消除启动子区H3K27三甲基化标记，直接促进红耳龟雄性性别决定基因Dmrt1的表达。并且，Dmrt1的过表达能够恢复由Kdm6b缺陷引起的性逆转。该项研究阐明了Kdm6b在红耳龟TSD中的生物学功能及其作用机制，为“表观遗传机制调控TSD”假说提供了首个直接的遗传证据，继而为进一步破译TSD机制奠定基础（点击阅读）。

温度依赖型性别决定（temperature-dependent sex determination，TSD），是一种奇特的表型可塑性现象，其特征是动物缺乏性染色体，性别完全取决于胚胎发育的环境温度，常见于爬行动物（如龟）。自1966年Charnier发现TSD现象以来，其分子机理一直是未解之谜。TSD机制的解析主要在于解答两个科学问题：（i）哪个（些）基因启动未分化性腺向睾丸或卵巢分化？（ii）温度如何调控这些基因的表达？Charnier团队前期通过新建立的基因功能研究方法，鉴定了一个启动中华鳖和红耳龟雄性性腺分化的关键基因Dmrt1。因此，破译TSD分子机制的关键在于解析温度通过何种机制激活或抑制性腺分化启动基因的表达？

STAT3磷酸化是温度依赖性的，具有性二态性（图源自Science ）

许多爬行动物的性别取决于卵在巢中发育的温度。例如，在红耳龟（T. scripta）中，胚胎双能性腺在31°C [产雌温度（FPT）]时分化成卵巢，而在26°C [产雄温度（MPT）]时分化成睾丸。然而，这种依赖温度的发育转换的分子机制仍然难以捉摸。先前的研究表明，表观遗传调节剂KDM6B（JMJD3，组蛋白去甲基酶）是在26°C下表达保守的雄性别决定基因Dmrt1所必需的。在没有KDM6B的情况下，雄性基因不会被激活，而雌性途径会被启动，从而导致卵巢的形成。KDM6B本身并非固有地对温度响应，这表明上游的热敏调节剂必须提供温度与性别特异性基因表达之间的缺失联系。

pSTAT3在31°C结合Kdm6b并抑制转录（图源自Science ）

STAT3是控制Kdm6b表达的转录因子，它是这种调节剂的一个候选对象。STAT3的二聚化和转运到细胞核取决于磷酸化，磷酸化可以通过响应环境或生理刺激的多种信号传导途径发生。该研究的分析表明，在红耳龟胚胎中，在整个温度感应窗口（第14到20阶段）中，STAT3的转录本和蛋白质水平在26°和31°C时都相似。用磷特异性抗体进行的免疫荧光显示，在第15和第17阶段的整个胚胎生殖腺中，在31°C时，磷酸化的STAT3（pSTAT3）的水平升高，到20阶段时大部分局限于皮质。根据这些结果，研究人员假设pSTAT3在31°C结合Kdm6b基因座，并作为Kdm6b转录的抑制剂。

通过抑制Kdmb6可以逆转pSTAT3抑制诱导的从卵巢到睾丸途径的转换（图源自Science ）

为了测试pSTAT3是否结合Kdm6b基因座，研究人员在第16阶段收集了红耳龟性腺，并对pSTAT3进行了染色质免疫沉淀（ChIP），然后使用引物对Kdm6b基因座5'端的两个保守pSTAT3结合位点进行了定量聚合酶链反应（qPCR）。 pSTAT3在31°C时在Kdm6b基因座富集，其结合被HO-3867阻断，HO-3867是STAT3磷酸化和DNA结合的抑制剂。

细胞内[Ca2 ]在31°C时升高与STAT3的温度依赖性磷酸化有关（图源自Science ）

为了确定pSTAT3是否可作为Kdm6b的阻遏物，研究人员将14阶段全性腺-中甲复合物（GMCs）移植到31°C或26°C的器官培养物中。GMC暴露于两种具有不同作用机理的pSTAT3抑制剂之一HO-3867或NSC 74859（S31-201，STAT3磷酸化和二聚化抑制剂），并在24小时后收集进行分析。根据免疫荧光和蛋白质印迹分析，两种抑制剂处理后pSTAT3的水平均下降。逆转录后接qPCR（RT-qPCR）显示，在暴露于任何一种STAT3磷酸化抑制剂后，Kdm6b及其下游靶标Dmrt1的表达均在31°C上调。在26°C下，任一pSTAT3抑制剂均未显著影响Kdm6b的表达。这支持了一个模型，其中pSTAT3抑制FPT处的Kdm6b转录。

为了确定pSTAT3抑制在体内是否具有相似的作用，研究人员在第14阶段向卵中注射了递增剂量的HO-3867（25、50和100μM），并在第16和21阶段收集了性腺。与器官培养结果一致，pSTAT3抑制导致在31°C孵育的卵中Kdm6b和Dmrt1的上调。因此，经第21阶段性腺中SOX9蛋白的异位表达确定，经HO-3867处理的23枚卵中有16枚（69.6％）表现出卵巢向睾丸的转换。但是，在31°C抑制pSTAT3后，Dmrt1的上调可以通过用Kdm6b–RNAi（RNA干扰）敲低Kdm6b的表达来防止，从而使卵巢发育恢复了92.9％（14中的13）。这些数据进一步支持了pSTAT3结合Kdm6b基因座以在31°C抑制雄性途径激活的模型。

STAT3的磷酸化可以通过钙信号通路来调节，该信号通路可以响应包括温度在内的环境信号。为了研究温度驱动的钙信号传导与性别决定之间的可能关系，研究人员从第15阶段的红耳龟性腺获得了原代细胞。将单波长钙指示剂Cal-520乙酰氧基甲酯（Cal-520 AM）引入培养的这些细胞中，以测量26°C或31°C时的相对钙水平。总的来说，这些结果表明在31°C较高的钙水平促进STAT3磷酸化。

综上所述，该研究支持一种新的红耳龟性别决定模型。根据该模型，在较高温度（31°C）下，卵巢的发育是由钙大量流入性腺细胞引起的。这促进了STAT3的磷酸化和Kdm6b的抑制，Kdm6b是睾丸决定通路的必需激活剂。

参考消息：

https://science.sciencemag.org/content/368/6488/303