动物学习行为的应用（小动物行为分析软件推荐和实验示例）

Supermaze小动物行为分析软件，XR-Xmaze，上海欣软

Visutrack小动物行为学分析软件，XR-VT，上海欣软

下面就以实际的实验案例看看软件分析出来的效果：

原文为王 黎，史清海等老师发表的《银杏内脂Ｂ对急性缺氧后大鼠 焦虑样行为的干预作用》

由于高原特有的缺氧、低气压、强紫外线等一系列环境条件，急进高原过程中士兵常常会伴随有生理和心理的应激反应。其中心理应激会使人产生焦虑、抑郁甚至精神分裂等情绪变化，严重影响军队的战斗力。因此研究能够有效预防或治疗急性缺氧条件所致焦虑样情绪的药物十分重要。

银杏内酯B（GinkGolide B，GB）是银杏叶提取物中的主要成分之一，成份主要为萜类内酯，已有研究表明，在急性缺氧条件下，GB有抑制神经细胞凋亡和氧化应激的作用，从而保护神经细胞，缓解大鼠的认知功能障碍，本研究作者推测GB的这种保护神经细胞的作用可能也会改善缺氧所致焦虑行为的产生。但另一报道显示虽然银杏叶提取复合物（成分包括银杏内酯A、B、C和白果内酯）在动物实验中表现出抑制小鼠焦虑样行为的作用，但这种抗焦虑作用主要是由银杏内酯A提供，而不是GB。为了探讨GB是否有抗焦虑的作用，本研究使用旷场实验（Open Field Test，OFT）和高架十字迷宫（elevated plus maze，EPM）实验评价急性缺氧条件下的大鼠焦虑样行为，以期为缺氧所致焦虑的预防和治疗提供新的药物选择。

1.1实验动物

SPF级成年雄性SD大鼠36只，体质量（200±20）G，购自新疆医科大学动物实验中心，实验动物质量合格证号：20111125008。

1.2试剂与仪器

• 高原人工实验舱；
• EPＭ实验仪器（型号：XR-XG201，上海欣软信息科技有限公司）；
• OFT实验仪器（型号：XR-XZ301ＸＲ－ＸＺ３01，上海欣软信息科技有限公司）；
• Supermaze动物行为学视频分析系统（上海欣软信息科技有限公司）；
• GB（货号：C３1Ｊ６G201４，纯度＞９８％）。

高架十字迷宫，EPM，XR-XG201，上海欣软

旷场实验箱，OFT, XR-XZ301，上海欣软

1.３实验SD大鼠饲养方法及分组

将SD大鼠在新环境下先饲养适应3d。所有大鼠均饲养在动物房中，保持室内温度（25±1）℃，每天12h昼夜交替，给予同种饲料喂养，可自由进食、饮水，采用玉米粒做垫料，每两天更换一次。实验时将大鼠分为３组，分别为平原对照组、高原缺氧组、GB干预组，各12只。其中GB干预组大鼠在进入高原人工实验舱之前每天固定时间给与120ｍG/kG剂量的GB灌胃，连续给药４d后与高原缺氧组大鼠一起进入高原人工实验舱。平原对照组大鼠一直在动物房中常规条件饲养。

1.４模拟急进高原条件

将GB干预组和高原缺氧组大鼠同时置于特殊环境人工实验舱内，以25ｍ/ｓ的速度快速升至６000ｍ海拔，自然24h昼夜交替，并不间断的以5.5l/ｍin的速度注入新鲜空气以提供饲养动物所需的氧气，同时排出二氧化碳，舱内温度维持在（24±2）℃，湿度40％～50％，大鼠自由摄进食物和水。实验期间观察大鼠在高原暴露期间的饮食、活动、情绪等状态，在舱内连续暴露6d后出舱，进行动物行为学实验的评价。

1.5动物行为学实验

实验开始之前，彻底清洁实验装置，采用窗帘将OFT和EPＭ与外界环境分隔开，室内暗光（以1.5ｍ距离处能区分大鼠细微活动的最低亮度为准）并保持恒亮，室温20℃左右，测试过程中保持周围环境安静。设置好相关程序参数，其中摄影记录为延迟5ｓ记录，共记录300ｓ。大鼠出舱后将其放置在实验室半小时以适应环境。实验开始时，将大鼠背对实验者从笼中取出（每次一只大鼠），放入旷场以及十字迷宫装置的中心，实验者立刻离开，使用动物行为轨迹跟踪系统采集大鼠在300ｓ内的活动信息。每只大鼠在完成测试后，使用７5％酒精将设备擦洗干净后，再进行下一只大鼠的测试。

1.６实验中需要记录的评价指标

OFT实验动物出现焦虑心理时，其对开阔环境和新异环境中的恐惧和探究的矛盾心理特性会反应在行为学上，表现为焦虑越严重，就越倾向于在周边区域活动，以获得一种安全感。因此，实验动物进入中央区域的次数越多，在中央区域活动的时间越长则说明动物的焦虑情绪越低。观察实验动物的运动总路程（Cｍ）、进入中心区域时间(s)、进入中心区域次数(n)。EPＭ实验主要是利用动物对新异环境的探究和对高悬开臂的恐惧形成矛盾心理来反应动物的焦虑状态。大鼠进入开臂时间和次数越多，说明大鼠焦虑程度越低，反之则说明其焦虑程度越高。观察实验动物的运动总路程（cｍ）、开臂时间百分比（％）、开臂次数百分比（％）。

1.７统计学处理

采用SPSS16.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（ｘ珚±ｓ）表示，两组间比较采用ｔ检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2.1 OFT结果

由动物行为轨迹跟踪系统采集的大鼠运动轨迹可以看到高原缺氧组大鼠相较于平原对照组大鼠在中央区域的运动轨迹明显减少，而GB干预组大鼠在中央区域的活动时间则和平原对照组相近，见图1。统计学分析后可以看出在到运动总路程、进入中心区域时间和次数上，高原缺氧组显著低于平原对照组和GB干预组，组间比较差异具有统计学意义（F＝10.991，P<0.01），而平原对照组和GB干预组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05），GB干预组与高原缺氧组比较差异具有统计学意义（P<0.05），见表1。以上结果说明高原缺氧环境会导致大鼠产生焦虑样行为，而GB的预给药可以改善大鼠的焦虑状态。

Supermaze小动物行为分析软件，行动轨迹图，上海欣软

2.2 EPＭ实验结果

由动物行为轨迹跟踪系统采集的大鼠运动轨迹可以看出高原缺氧组大鼠相较于平原对照组大鼠在开臂区的运动轨迹明显减少，而GB干预组大鼠在开臂区的活动时间则和平原对照组相近，见图2。运动总路程、开臂区活动时间百分比和进入次数百分比上，高原缺氧组显著低于平原对照组和GB干预组，组间比较差异具有统计学意义（F＝11.01６，P<0.05），但平原对照组与GB干预组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05），GB干预组与高原缺氧组比较差异具有统计学意义（P<0.05），见表2。

Supermaze小动物行为分析软件，行动轨迹图，上海欣软

焦虑是动物个体在面对潜在威胁和压力时产生的一种正常情绪反应，人体在急进高原后，由于低压、缺氧、强紫外线等环境的变化会造成一系列应激反应，从而产生焦虑、抑郁的心理应激改变，会对正常的生活和工作造成负面影响。有研究表明高原驻防官兵中存在大量焦虑、抑郁等心理症状的个体，并且这种焦虑和抑郁状态可增加慢性高原疾病的的发病风险，严重影响官兵的身心健康。近年来，传统中药在抗焦虑方面的作用得到越来越多的关注，有研究报道，红景天可通过增高海马神经细胞中的5－羟色胺含量，从而降低缺氧刺激下大鼠的焦虑样行为。另一中成药芪参复康胶囊也被证明有明显的抗焦虑抗抑郁的作用，效果甚至优于红景天。而本文则选用了另一种传统中药GB，并对其潜在的抗焦虑作用进行了初步研究。

本研究采用oFＴ和ePＭ两个经典实验来评价动物焦虑样行为。oFＴ的运动总路程反应大鼠的兴奋性，本实验可见GB干预组的运动总路程显著高于高原缺氧组，组间比较差异具有统计学意义（P<0.05），表明GB能改善缺氧造成的大鼠兴奋性下降。而ePＭ实验中，高原缺氧组大鼠进入开臂的时间和次数显著低于平原对照组和GB干预组，组间比较差异具有统计学意义（P<0.05），说明GB缓解了大鼠的焦虑情绪。本研究通过以上行为学实验，初步探讨了GB对缺氧导致的大鼠焦虑样行为的改善作用，但本研究实验设计仍存在一定问题，首先作者参考之前研究结果只选用了120ｍG/kG这一个最大用药剂量，而没有进行药物梯度的设定，不能说明GB的抗焦虑效果是否有药物剂量依赖性。其次，临床上对于病理性焦虑的治疗常采用苯二氮卓类药物，如地西泮，该类药物是通过作用于抑制性递质γ－氨基丁酸A受体的ＺA位点发挥其抗焦虑效应。因此在动物焦虑模型的相关研究中常使用地西泮做为阳性对照药物，而本实验中没有设立阳性对照组，降低了本实验结果的可靠性。以上问题都是接下来研究中需要改进的。

缺氧导致的焦虑是一个复杂的病理生理变化，牵涉到神经生化、神经内分泌等多方面的变化，其中神经递质5－羟色胺在焦虑动物模型中有显著的表达变化，其参与焦虑的产生由不同的受体介导。有研究表明GB可以阻断5－ＨＴ（３）A受体，提示这可能是GB发挥抗焦虑作用的机制之一。在中枢神经系统中，参与情绪调节的脑区，包括杏仁核、前额皮质、丘脑、海马和扣带回等脑部结构。其中，海马是参与情绪调节非常重要的脑区，在情绪变化、应激等信息整合过程中起主要作用，同时也是大量研究者观察神经可塑性变化的脑区。本课题组前期研究已经发现，在低压低氧条件下，GB可以改善大鼠的认知功能障碍，提示其潜在的保护海马神经元作用，这可能也是GB具有抗焦虑作用的原因之一。综上所述，本研究初步探讨了GB对缺氧导致的大鼠焦虑样行为的改善作用，为进一步探讨GB抗焦虑机制提供了稳定的动物模型和药物剂量参考。