诺奖研究成果（诺奖值得系列蛋白质折叠的分子伴侣诞生记）

弗朗兹-乌尔里希·哈特尔（左） 、亚瑟·霍里奇（右）

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因在蛋白质折叠的分子机制上的贡献，马克斯·普朗克生化研究所主任、德国生物化学家弗朗兹-乌尔里希·哈特尔（Franz-Ulrich Hartl，1957-）与耶鲁大学医学院的美国生物学家亚瑟·霍里奇（Arthur L. Horwich，1951-）几乎已经拿下了除诺奖外所有的生物化学及相关学科的国际大奖。

2011年，即屠呦呦获得拉斯克奖（The Lasker Awards）临床医学奖的同一年，哈特尔和霍里奇也获得了拉斯克基础医学奖。2020年，哈特尔和霍里奇又摘取另一诺奖风向标——美国生命科学突破奖，是诺奖预测名单上的常客。

蛋白质的折叠机制是重要的生物学问题。《知识分子》特别推出“诺奖值得”系列专栏，向读者介绍那些重要的科学发现及其背后的故事。

Talent hits a target no one else can hit; genius hits a target no one else can see.

人才及凡人所不能及，天才及凡人所不能见。—— 叔本华

撰文 | 王宗安（芝加哥大学计算化学博士）

责编 | 刘楚

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哈特尔的两大爱好

弗朗兹-乌尔里希·哈特尔出生于1957年的西德工业城市埃森（Essen），四岁时随父母搬迁到黑森林（Black Forest）北部的一个小镇。在林野间，捉蛙捕螈，蹚溪筑坝，哈特尔度过了美好的童年。自五岁，哈特尔开始学习乐谱，先后学会了木笛、长笛和钢琴，音乐成为了他保持终身的两大爱好之一。另一个爱好嘛，是生物学！确切地说，哈特尔对生物学的兴趣是捕捉、收集昆虫，制作标本，用显微镜观察。“引他入坑” 的是他的爷爷，一位业余显微镜大拿。进入高中后，哈特尔找到了新的爱好：生物化学。[1]

19岁，哈特尔进入海德堡大学（Heidelberg University）医学院学医。在完成必要医学训练的同时，哈特尔在生物化学系进修博士学位。期间，他发现肝细胞的一类细胞器过氧化物酶体（peroxisome），可以被甲状腺激素代谢激活并诱发大量增殖 [2]。

1985年，哈特尔的博士论文被送给慕尼黑大学的著名细胞生物学家瓦尔特·诺佩特（Walter Neupert，1939 - 2019）[3]评审。诺佩特很赏识这篇论文，邀请哈特尔来自己的实验室做博后研究—— 这成为了哈特尔人生至关重要的转折。

对哈特尔而言，这个转折有双重意义。一方面，导师诺佩特在1986年将他派往希腊参加分子生物学暑期学习，令他结识了未来的生活爱侣和科学良助玛纳吉特（Manajit）；另一方面，在诺佩特实验组研究线粒体吸收（import）新合成蛋白，催生了其分子伴侣的工作。

哈特尔与夫人玛纳吉特于2020年领取生命科学突破奖 | 照片版权：Miikka Skaffari

蛋白质折叠的安芬森法则

我们先谈谈蛋白质在细胞内怎么折叠。

1972年的诺贝尔化学奖得主克里斯蒂安·伯默尔·安芬森（Christian Boehmer Anfinsen, 1916 – 1995）曾这样猜想：小的水溶性蛋白质在生理环境条件下的天然结构仅取决于其氨基酸序列 [4]。这被称为安芬森法则（Anfinsen’s dogma），也被称为蛋白质折叠的热力学猜想（thermodynamic hypothesis）。

安芬森法则是今日蛋白质结构的计算预测的基石，说是公设也可以，是不容置疑的、需要提前承认的法则——在此公设框架下进行计算预测。

安芬森本人是基于对核糖核酸酶（ribonuclease A）的研究做出上述假说的。他观察到，令纯化的有生理活性的酶变性以至于其多肽长链打开（unfold），之后通过稀释溶液降低变性剂浓度，已经去折叠的蛋白会自发地重新获得酶活性。这表明，酶自发地、正确地折叠回去了，即，酶的氨基酸序列足以特异性地决定其三维结构以及酶活功能。

更明白地说，酶的折叠不需要其它蛋白质的协助，也无需输入额外的能量（如ATP）。

如此简洁、明白、优美的物理理解在当时并不容易被接受，甚至可谓石破天惊。多年后本文的另一位主人公——亚瑟·霍里奇回忆 [5]，“安芬森得诺奖时，自己与实验室的组员连着讨论了好多天，简直让人惊呆了，安芬森真胆大包天啊，怎么会期待让变了性的蛋白再折叠回去、恢复功能？”

当然安芬森法则所描述的折叠发生于所谓 in vitro（体外）实验条件下。在细胞内的蛋白质折叠，即 in vivo（体内），即使基本法则不变，情况也复杂得多得多。

大家可以想象：一个接一个的氨基酸在蛋白质的制造工厂 —— 核糖体内被缀链到一起，生成一个新的蛋白；这个新蛋白，犹如一段挤出来的牙膏，离开核糖体，进入细胞质（cytosol）。这个还没有折叠的蛋白质长链上的一些氨基酸残基又油又黏，另一些则又润又滑。油腻的残基倾向于聚合而包埋到蛋白质内部，水润的残基倾向于暴露朝外，与外部水溶液接触。

现在问题来了：细胞内非常拥挤，充满了各种折叠的、半折叠的、未折叠、甚至错误折叠的蛋白质分子，如何能保证自己的折叠不受旁边分子的干扰呢？

发现折叠酶

自60年代安芬森提出蛋白质折叠的热力学假说，近30年间，基石般的法则左右了整个生物学界对待蛋白质折叠问题的态度。哈特尔回忆 [5]，“细胞生物学家就是对蛋白质折叠不感兴趣，这是研究试管里蛋白质自发反应的生物物理学家和生物化学家的领域。”

直到80年代末，两位年轻人的科研轨迹相互交叉。

年龄稍大的霍里奇结束儿医住院医师训练后回到耶鲁大学，加入了医学院院长里昂·罗森博格（Leon Emanuel Rosenberg，1933-）的课题组。仍然对蛋白折叠心心念念的霍里奇希望能挑一个儿科病，结合当时已有的DNA重组技术，从分子生物学角度阐明它的致病机理。他瞄上的是一种罕见的X染色体遗传病：鸟胺酸氨甲酰基转移酶（ornithine transcarboxylase deficiency，OTC）缺乏症。OTC是一种线粒体酶。遗传有这种致命疾病的新生儿不能正常代谢尿素，血氨增高。

霍里奇研究发现 OTC 在细胞溶胶内合成，然而必须要进入线粒体，才能发挥功能。利用酵母作为载体筛查人体酶的基因突变，他发现一种特殊的酵母突变体能够将OCT运输入线粒体，但是OTC却没有酶活。那么这时可能有两种情况：（1）OTC其实没有真正进入线粒体；（2）OTC进入了线粒体，但没有正确折叠，因而无法发挥催化功能。

话分两头。此时大西洋的另一边，哈特尔刚刚开始研究蛋白质在细胞内的输运，特别是蛋白质如何进入线粒体。在研究过程中，哈特尔认识到，蛋白质必须先打开，进入线粒体之后再重新折叠功能状态。—— 这可不巧了嘛，霍里奇和哈特尔的研究互补了！

蛋白质进入线粒体示意图[6]

1988年，哈特尔的导师诺佩特给霍里奇打了一个越洋电话。霍里奇几乎放下电话就去买了飞往慕尼黑的机票。[5]

面对霍里奇带来的结果，诺佩特和学生们尽管感到很兴奋，却依旧保持怀疑 —— 如果要证明存在一种辅助OTC折叠的蛋白质，必须要证明 OTC 完全进入了线粒体，因为OTC可能在穿过线粒体膜的过程中“卡住”，而这种情况下呈打开状态的OTC可能会被从中切断而失去活性。—— 这时，哈特尔主动请缨，自己来做这个实验。

仅仅几周，哈特尔就做出实验结果—— OTC的确完全进入了线粒体。这意味着，线粒体内确实存在一种折叠酶（foldase）。哈特尔、霍里奇以及诺佩特等人于1989年在 《自然》上发表了两篇标志性论文 [7-8]：安芬森法则统治蛋白质折叠的时代结束了。

哈特尔在32岁用了几个星期做出了让他在日后蜚声科学界的工作。

文献 [7] 证明一种名为hsp60的线粒体内的热休克蛋白在进入线粒体的蛋白的组装过程中起关键作用。因为 hsp60 符合约翰·埃利斯（John Ellis）在1987年对 “分子伴侣”（molecular chaperone）的定义，所以被归纳为一种分子伴侣蛋白。[9] 这篇论文的首作者郑明媛（CHENG Ming Y.，右上角）是霍里奇的最早的研究生之一， 现已从台湾省国立阳明大学生命科学系暨基因体科学研究所退休。霍里奇形容她为 “无所畏惧的实验学家”。[10-11]

文献 [8] 则进一步证明线粒体内的蛋白质折叠必须要hsp60，并且消耗ATP水解的能量。

分子伴侣：热休克蛋白

哈特尔和霍里奇一同荣获过许多奖项，包括2011年的拉斯克基础医学研究奖。荷兰遗传学细胞生物学家、洛克菲勒大学教授蒂蒂亚·德朗厄（Titia de Lange）是二人获得拉斯克奖的现场介绍人。

德朗厄在介绍二人获奖工作时做了一段很精妙的比喻，来说明热休克蛋白hsp60的功能：

“Hsp60体系像一座监狱能够将蛋白质囚禁在单人牢房—— 这就像是美国的监禁制度（American penal system），只是去掉了无人道的（inhumane）部分，并且更加高效。Hsp60形如圆桶，抓住去折叠蛋白分子的黏性部分，将之拽入桶内，并关闭桶盖。此时陷入hsp60的蛋白分子尝试各种姿态构象进行折叠，而不必碰撞其它蛋白质分子。Hsp60的桶壁高度带电。蛋白质分子被关押在桶内约10秒，可以想象，它在此过程中挣扎、扭动，碰撞墙壁，直至桶门打开。越狱犯可能完成了正确折叠，成为了细胞内茫茫蛋白中的一位好好公民，也可能还没有完成折叠。那么这样的累犯会迅速被捕获、押解入另一个囚笼。这个先擒后纵的过程可能往复十次，才最终令一条多肽链正确折叠，进而获得保释，允许出狱，如同一个模范公民，去履行自身的职责，再也不与其它蛋白质分子有非分接触。”

“哈特尔和霍里奇的工作大大加深了我们对细胞生命功能的理解，在医学、药学方面有广泛应用。几乎所有蛋白质在其熟化（maturation）过程中都需要分子伴侣的某种形式的参与，而几乎所有生命体都使用 “单独囚禁” 的方式驱策它们的一部分蛋白正确折叠。分子伴侣-辅助的蛋白质折叠给我们提供许多洞见，以理解因蛋白变异而导致的疾病，如阿尔茨海默症、帕金森症、卢·贾里格症（又称肌萎缩性脊髓侧索硬化症、渐冻症）等。” [6]

Hsp60-Hsp10 分子伴侣复合体功能示意图[12]

哈特尔的学术家谱

笔者叙述科学家事迹有一个习惯：总免不了考察他的学术家谱。哈特尔是德国培养的科学家，在当前美国的生命科学整体领先欧洲及东亚的大背景下，追索一下他的师承脉络，可能会给我们带来一些有益的启发。

哈特尔的学术生涯里先后有三位导师：博士导师、化学家、海德堡大学医学院教授 Hans Schimassek，博后导师、细胞生物学家、慕尼黑大学教授瓦尔特·诺佩特，博后导师、生物化学家、达特茅斯学院教授威廉姆·维克纳（William T. Wickner）[12]。

哈特尔曾自述在诺佩特教授处的经历是其人生重大转折，那么我们重点攀着诺佩特的师承谱系树上行看一看。

笔者根据 academictree.org、维基百科、nobelprize.org 等网站整理，自最左诺佩特向右显示了学术代际继承关系，黑色箭头附近的红色字体表明导师与学生的具体关系以及前者指导后者的时间。每位科学家所属的主要领域写在其生卒年下方。特别地，我用蓝色字体标出学生在导师处的主要研究方向；例如，诺佩特在其博士导师西奥多·布夏（Theodor Bücher）处的主要工作是研究线粒体的形成与形态。[13]

这张图展现的7位科学家中，有几位的名字格外响亮。

奥托·海因里希·瓦尔堡（Otto Heinrich Warburg）因为其对呼吸酶的发现和研究而荣获1931年诺贝尔生理学医学奖。

赫尔曼·埃米尔·费歇尔（Hermann Emil Fischer）因为其对嘌呤和糖类的合成而荣获1902年诺贝尔化学奖，但他更出名的是以其名字命名的费歇尔投影式（Fischer projection），本科有机化学课必讲内容。

奥古斯特·凯库勒（August Kekulé）可能更著名一些，毕竟苯环的凯库勒式（Kekulé structure）进入的是高中课本，甚至他的梦（Kekulé's dream）—— 因为梦见头尾相衔的蛇（ouroboros）而想出了苦苦思索的苯环结构，都进入了高中教材。

阿道夫·冯·拜尔（Adolf von Baeyer）因为合成靛蓝（indigo）而荣获1905年诺贝尔化学奖，落后于他的博士生费歇尔，没办法学生太优秀了；他还发现了酚酞，进入了初中教材。

我们可以看到，费歇尔→瓦尔堡→布夏→诺佩特→哈特尔，他们的研究一脉相承，渐次推进，非常连贯。瓦尔堡在博士期间细致地研究多肽分子在与呼吸有关的氧化反应中发挥的作用和代谢机理，并且由于自己的医学背景，使得布夏在博士期间致力于理解血红蛋白的氧化还原反应；进而，当诺佩特开始读博，研究细胞呼吸作用的线粒体如何形成、如何功能则成为当时细胞生物学的研究焦点；接着，哈特尔恰逢其会地由对线粒体输运蛋白的研究发现分子伴侣。顺理成章。

参考文献：

[1] Autobiography of Franz-Ulrich Hartl (2012)

[2] Die Steuerung peroxisomaler Enzymaktivitäten durch Schilddrüsenhormon in der Leber der Ratte. DNB 850819857, Dissertation, Heidelberg 1985.

[3] Obituray: Water Neupert (1939 – 2019), Cell 178, August 22, 2019

[4] Principles that Govern the Folding of Protein Chains, Science 181 (1973) 223-230

[5] A mystery unfolds: Franz-Ulrich Hartl and Arthur L. Horwich win the 2011 Albert Lasker Basic Medical Research Award

[6] laskerfoundation.org/winners/chaperone-assisted-protein-folding/

[7] Nature 337 (1989) 620

[8] Nature 341 (1989) 125

[9] John Ellis, Proteins as molecular chaperones, Nature 328 (1987) 378

[10] Arthur L. Horwich, Chaperonin-mediated Protein Folding, J. Biol. Chem. 288 (2013) P23622

[11] dls.nycu.edu.tw/faculty/faculty-member.html

[12] atlasgeneticsoncology.org/Genes/GC_HSPD1.html

[13] academictree.org/cellbio/peopleinfo.php?pid=57559

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