免疫荧光蛋白染色实验步骤 免疫荧光组织细胞

一、免疫荧光组织（细胞）化学染色方法：直接法

（一）基本原理

将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。

（二）试剂与仪器

磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4

荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释

缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份 pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制

搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）

有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）

荧光显微镜

玻片架

滤纸H

37℃温箱等。

（三）实验步骤

1、滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。

2、滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。

3、取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。

4、取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。

5、立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“ ”表示：

（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（ ）荧光较弱，但清楚可见；（ ）荧光明亮；（ -- ）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“ ”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。

（四）注意事项

1、对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。

2、染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。

3、为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。

⑴标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。

⑵特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。

⑶阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。

如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。

4、一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。

二、免疫荧光组织（细胞）化学染色方法：间接法

（一）原理与意义

免疫荧光组织（细胞）化学染色方法——间接法，是一种荧光抗体染色法。该方法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原，敏感性较高，操作方法较易掌握，而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体（如麻疹）等的研究和检查，所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血清的试验。

（二）操作流程

1、双层法（Double Layer Method）

⑴切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37℃作用30min。然后用0.01mol/L pH7.2 PBS洗两次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液体。

⑵再滴加间接荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等），同上步骤，染色30min，37℃，缓冲盐水洗两次10min，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。

⑶对照染色

①抗体对照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法进行染色，结果应为阴性。

②抗原对照：即类属抗原染色，亦应为阴性。

③阳性对照。

2、夹心法：未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在，方法步骤如下：

⑴切片或涂片固定后，置于染色湿盒内。

⑵滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃，30min。

⑶缓冲盐水洗2次，每次5min，吹干。

⑷滴加特异性荧光抗体再用切片于37℃，30min。

⑸如③水洗。

⑹缓冲甘油封固，镜检并拍照。

三、免疫荧光组织（细胞）化学染色方法：补体法

（一）原理与意义

免疫荧光组织（细胞）化学染色方法——补体法，是一种荧光抗体染色法。本法之荧光抗体不受免疫血清的动物种属的限制，因而一种荧光抗体可作更广泛的应用，敏感性亦较间接法高，效价低的免疫血清亦可应用，节省免疫血清，尤其是对检查形态小的如立克氏体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质时甚为理想。

（二）操作指南

1、材料

⑴免疫血清60℃灭活20min，用Kolmers盐水作2倍稀释成1：2，1：4，1：8……。补体用1：10稀释的新鲜豚鼠血清，抗补体荧光抗体等，按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价，如为1：32则免疫血清应作1：8稀释。

⑵补体用新鲜豚鼠血清一般作1：10稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果，按2单位的比例，用Kolmers盐水稀释备用。Kolmers盐水配法：即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲盐水中，溶解MgSO4的含量为0.01%浓度。

⑶抗补体荧光抗体：在免疫血清效价为1：4，补体为2单位的条件下，用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价，然后按染色效价1：4的浓度用Kolmers盐水稀释备用。

2、操作步骤

⑴涂片或切片固定。

⑵吸取经适当稀释之免疫血清及补体之等量混合液（此时免疫血清及补体又都稀释一倍）滴于切片上，37℃作用30min，置于保持一定湿度的染色盒内。

⑶用缓冲盐水洗2次，搅拌，每次5min，吸干标本周围水液。

⑷滴加经过适当稀释之抗补体荧光抗体30min，37℃，水洗同（3）。

⑸蒸馏水洗1min，缓冲甘油封固。

3、对照染色

⑴抗原对照。

⑵抗血清对照：用正常兔血清代替免疫血清。

⑶灭活补体对照：将补体经56℃ 30min处理后，按补体同样比例稀释，与免疫血清等量混合后，进行补体法染色。

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