血清抗体的制备与检测实验报告（免疫血清的制备实验）

【实验原理】

将适量目的抗原经合适途径注射动物，刺激动物发生免疫应答，产生特异性抗体。抗体存在于血清中，含有目的抗体的血清称为免疫血清。高效价、高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂（如用于制备免疫标记抗体等），也可供特异性免疫治疗用。免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术。制备方法因抗原的性质不同而异，下面以制备家兔抗人IgG免疫血清为例作具体说明。

【材料与仪器】

1. 健康成年家兔，雄性，体重2～3kg。

2. 灭菌生理盐水、纯化人IgG（10mg／ml）、消毒酒精及碘酒、羊毛脂、石蜡油、活卡介苗（BCG）（75mg／ml）。

3.剪刀及镊子、注射器（2ml、50ml）、称量瓶（10ml）、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶（200ml）、手术器械一套、血管夹、黑丝线及塑料放血管、研钵。

【实验方法】

（一）抗原及佐剂的制备

1. 弗氏不完全佐剂（FIA）的制备：称羊毛脂10g，逐滴加入优质石蜡油40ml，边滴边研磨，分装于疫苗瓶中（每瓶10ml），高压灭菌（55.21kPa20min）后保存备用。2.弗氏完全佐剂乳化抗原（FCA－IgG）的制备：将FIA预温（60℃30min），吸取3ml于研钵中，逐滴加入活BCG（75mg／ml）0.5ml及纯化人IgG（2.4mg／ml）2.5ml，边滴入边研磨，直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上，以不散开为合格。

（二）免疫动物

1. 用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛，用酒精及碘酒消毒皮肤。

2. 第一次免疫：用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂（FCA）乳化的抗原（人IgG）（简称FCA－IgG）液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。

3.第二次免疫：间隔10～14天后，于两侧腘窝及足蹊部肿大的淋巴结内注入FCA－IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧腘窝及足蹊部皮下。

4.间隔7～10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价（即试血）。效价至少应达到1∶16以上时才能放血。

5.若效价未达到要求，可用不加佐剂的抗原液（人IgG）耳静脉内注射免疫。于1周内注射3次，分别为0.1、0.3、0.5ml，间隔1周再试血。如效价达到要求应立即放血。另外，也可在第二次免疫后，用弗氏不完全佐剂（FIA）乳化的抗原（人IgG）（简称FIA－IgG）再免疫1～2次注射部位、剂量和间隔时间均同第二次，再试血测抗体效价，如效价达到要求立即放血。

（三）分离血清

1. 心脏采血法

（1）家兔仰卧，四肢缚于动物固定架上（或由助手抓住四肢固定）。

（2）剪去左胸部兔毛，消毒皮肤。

（3）用左拇指摸到胸骨剑突处，食指及中指放在右胸处轻轻向左推心脏，并使心脏固定于左胸侧位置。然后，以左拇指触摸心脏搏动最强的部位。

（4）用50ml注射器（连接16号针头），针倾斜45°角，对准心搏最强处刺入心脏抽血致死。

（5）将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中。

（6）将三角烧瓶内的血置37℃温箱1h，再置4℃冰箱内3～4h。

（7）待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。

（8）3000r／min离心15min，取上清加入防腐剂终浓度（0.01％硫柳汞或0.02％叠氮钠），分装后置4℃冰箱中保存备用。

2. 颈动脉放血法

（1）家兔仰卧同上固定。头部略放低以暴露颈部，剃毛及消毒皮肤。

（2）沿颈部中线切开皮肤约10cm，分离皮下组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌。分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后使之游离。

（3）于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线，近心端的动脉用血管夹夹住。

（4）用尖头小剪刀在两根丝线间的动脉壁上剪一小口，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱。

（5）松开血管夹，使血液流入灭菌三角烧瓶中。一般一只家兔可放血80～100ml。

（6）将三角烧瓶的血置37℃温箱中1h，再置4℃冰箱内3～4h。

（7）待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。

（8）3000r／min离心15min，取上清加入防腐剂（终浓度，0.01％硫柳汞或0.02％叠氮钠），分装后置4℃冰箱中保存备用。以双相琼脂扩散试验测定所获免疫血清的抗体效价，并用琼脂免疫电泳鉴定免疫血清中抗体的质量，应产生单一的沉淀弧线。鉴定方法的具体步骤参见有关部分。