实验室t值的计算（TUNEL结果实验报告及结果展示-上海郑核）

冰冻切片 dab tunel 实验报告

1.实验器材及试剂

1.1 实验器材 名称 厂家 型号 冰冻切片机 Thermo Cryotome E 载玻片 Servicebio 盖玻片 江苏世泰实验器材有限公司 10212432C 脱色摇床 Servicebio TSY-B 涡旋混合器 Servicebio MX-F 掌上离心机 Servicebio D1008E 移液枪 Dragon KE0003087/KA0056573 组化笔 Servicebio WG1066-1 冰箱 青岛海尔股份有限公司 BCD-192TGN 显微镜 Nikon E100 成像系统 日本尼康 NIKON DS-U3

1.2 主要实验试剂 试剂 厂家 货号 4%多聚甲醛 Servicebio G1101 PBS 缓冲液 Servicebio G0002 蛋白酶 K Servicebio G1205 破膜液 Servicebio G1204 3%双氧水 Servicebio 苏木素染液 Servicebio G1004 苏木素分化液 Servicebio G1039 苏木素反蓝液 Servicebio G1040 中性树胶 国药集团化学试剂有限公司 10004160 Tunel 试剂盒 Servicebio G1507 DAB 显色剂 Servicebio G1212

2.冰冻切片 tunel 实验步骤

2.1 冰冻切片固定：冰冻切片 37℃烘箱烘烤 10-20min，控干水分。置于 4%多聚甲醛固定 30min，于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。

2.2 修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶 K 工作液覆盖组织，37 度温箱孵育 20min。将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗 涤 3 次，每次 5min。

2.3（可选步骤）破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育 20min， 将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。

2.4 阻断内源性过氧化物酶：将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每 次 5min。切片放入 3%双氧水溶液，室温避光孵育 20 min，将玻片置于 PBS（PH7.4）中在 脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。

2.5 室温平衡：切片稍甩干后在圈内滴加 buffer 覆盖组织，buffer 常温孵育 10min.

2.6 加反应液： 去掉平衡液，Recombinant TdT enzyme：Biotin-dUTP Labeling Mix：Equilibration Buffer=1 μL：5 μL：50 μL 比例混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃温箱孵育 1 小时，湿盒内加少量水保持湿度。

2.7 加 Streptavidin-HRP 反应液：将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次， 每次 5min。 Streptavidin-HRP 和 TBST 按 1：200 比例混合，加到圈内覆盖组织，切片平放 于湿盒内，37℃温箱孵育 30min。将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次， 每次 5min。

2.8 DAB 显色：切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的 DAB 显色液，显微镜下控制显色时间， 阳性为细胞核呈棕黄色，纯水冲洗切片终止显色。

2.9 复染细胞核：苏木素复染 1min 左右，纯水洗涤，分化液分化数秒，纯水洗涤， 氨水返蓝，纯水冲洗。

2.10 脱水封片：将切片经 4 缸 100%酒精脱水，每缸 5min, 随后在正丁醇中浸泡 5min, 放入二甲苯中进行透明，时间 5min 以上，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。 3.冰冻切片 tunel 结果判读 苏木素染细胞核为蓝色，DAB 显出来的阳性凋亡细胞核为棕黄色

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