微生物检验的基本方法（微生物检验常见问题解答）

问、灭菌锅化学检验和生物检验是每次实验都需要做吗？还是定期检验一下灭菌锅的性能呢？ 答：化学法是每次都要做的，生物法可以定期做，根据灭菌锅的使用频率，每周、每半月或每月做一次即可，下面我们就来说一说关于微生物检验的基本方法?我们一起去了解并探讨一下这个问题吧!

微生物检验的基本方法

问、灭菌锅化学检验和生物检验是每次实验都需要做吗？还是定期检验一下灭菌锅的性能呢？ 答：化学法是每次都要做的，生物法可以定期做，根据灭菌锅的使用频率，每周、每半月或每月做一次即可。

问：沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）上会不会生长细菌？ 答：SDA不是选择性培养基，而是一种广谱的增菌培养基，pH范围5.4-5.8，某些细菌是可以在SDA上生长的，霉菌和酵母菌总数计数时SDA上生长的菌均应计入霉菌和酵母菌总数；或者可以经过评估选择含有抗生素（如氯霉素）的SDA或者玫瑰红钠琼脂培养基进行霉菌和酵母菌总数计数。

问：琼脂培养基为什么需要倒置培养？ 答：在进行微生物培养时，若正置培养，琼脂培养基中的水分易蒸发使平板干裂，不利于微生物的生长；同时水蒸汽会在平皿盖上形成冷凝水，若回落在培养基表面，会使菌落蔓延生长，无法计数，若冷凝水太多会使培养基与平皿分离，容易滑动倒置培养可减少培养基表面的空气流动，减慢培养基中水分蒸发的速度，充分维持弹性，有利于菌株的生长和繁殖，防止空气中杂菌对培养基及培养物造成污染；也会由于重力作用在一定程度上使营养物质沉积到培养基表面，有利于微生物利用营养物质；倒置的平板方便拿取，避免环境中杂菌的污染。需要注意的是，《食品安全国家标准 食品微生物学检验霉菌和酵母计数》（GB4789.15-2016）是要求正置培养，而非倒置，以防霉菌孢子形成次生菌落，影响计数结果。

问：食品企业的环境检测应该依据那个标准？答：GB/T16294-2010《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》都有规定，可以做为参考。

问：请问高压灭菌锅需要操作人员有压力容器操作证吗?有些人说属于《特种设备安全监察条例》需要操作证？答：CNAS-CL 01-A001: 2018的 6.2.2.2条款里有说讲到，如实验室使用的高压蒸汽灭菌器不属于简单压力容器(定义参见TSG R0003 -2007《简单压力容器安全技术监察规程》)时，操作人员需持有特种作业人员证。

问：一些不常用的培养基开瓶后在效期内较长时间没有用完，那么这些开瓶后的培养基需要进行复验吗？答：开瓶后的培养基，如果长时间不使用，还在效期内，建议开瓶后间隔1年进行复验。如果出现结块，则不能使用。同理，如果同一批次一次购买量较多，一年内未使用完，也建议进行复检。

问：控制菌检查法中用到的培养基，在做培养基适用性的时候，其中有“指示特性”的表述，那么“指示特性”是指的什么意思？答：培养基指示特性包括菌落大小、形态特征、指示剂反应情况（菌落颜色变化）等。例如大肠埃希氏菌在麦康凯琼脂培养基上桃红色菌落有沉淀环、乙型副伤寒沙门菌在XLD有黑心等。

问：什么是不可接受微生物？答：不可接受微生物通常是指那些已知有明显致病性的，存在足够的数量，通过产品的给药途径可能导致患者不可接受风险的微生物。如何确定一种微生物是不可接受的，需要进行风险分析，包括微生物负载量、微生物特性、产品特性、给药途径、对患者潜在影响等。

问： 培养基灭菌没有按照厂家提供的灭菌参数进行，是否可行？答：可以。厂家产品说明书提供的灭菌参数可作为参考使用，使用单位也可以根据自己实验室的实际情况，在相关法规要求内，使用自己验证过的灭菌参数来执行。【法规来源：中国药典2020版9203药品微生物实验室质量管理指导原则 ……培养基灭菌应按照生产商提供或使用者验证的参数进行……】

问：革兰氏染色有哪些注意事项？

答：（1）最好挑选18-24h的菌落进行革兰氏染色,培养时间过久的的革兰氏阳性细菌可能会被染成红色而造成假阴性。

（2）挑取适量的菌，不宜过多,均匀涂开。

（3乙醇脱色是革兰氏染色是否成功的关键,15-30s为宜，脱色不够可能会造成假阳性,脱色过度可能会造成假阴性。

问：如何根据实验需要制备斜面？

答：根据实验需求，摆放斜面一般有三种形式：

（1）长斜面：斜面底部刚覆盖试管底部，上部距管口2.5-3cm左右；例如TSA传代斜面。

（2）高层斜面：斜面与底层高度约为2:3，即底部高约3cm，斜面长度约2cm；如三糖铁高层斜面。

（3）普通斜面：斜面底部距试管底部约1cm，上部距管口约2.5-3cm。

问：三糖铁培养基颜色变化原理是什么？

答：该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1，只能利用葡萄糖的细菌，分解葡萄糖产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。而发酵乳糖的细菌则产生大量的酸，使整个培养基呈现黄色。如菌种接至培养基培养后产生黑色沉淀，是因为某些细菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢和培养基中的铁盐反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀。

问：如果三糖铁上斜面红色、底层黄色，中间有黑色且产气，能否判定为沙门菌？答：不能。某些非沙门菌也能在三糖铁上呈现和沙门菌一样的颜色变化，例如奇异变形杆菌。如三糖铁上有上述颜色变化，需要进一步的进行适宜的鉴定试验，确证是否为沙门菌。如果采用传统的生化鉴定，可参考GB 4789.4-2016中沙门氏菌检验的方法。