抗甲醇催化剂的综述（BioresourceTechnology半理性设计提高米黑根毛霉脂肪酶的甲醇耐受性和催化活性用于一步合成生物柴油）

今天推送的文章发表在Bioresource Technology上的“Improvement of methanol tolerance and catalytic activity of Rhizomucor mieheilipase for one-step synthesis of biodiesel by semi-rational design”，作者为中国科学院广州能源研究所的罗文。

对环境安全的日益关注和对工业燃料的高需求表明迫切需要寻找替代和可持续的清洁能源。生物柴油（脂肪酸甲酯，FAME）是一种新兴的可再生能源，其燃烧后的废气不含硫或芳香族化合物。作为化石柴油燃料的替代品，它易于生物降解、无毒且环保。将废油和脂肪转化为生物柴油也消除了这些废物的有害处置对环境造成的负面影响。

生物柴油由长链脂肪酸的单烷基酯组成，通过甘油三酯和短链醇（乙醇和甲醇）的酯交换反应生产。碱（例如NaOH）、酸（例如HCl、H₂SO₄和H₃PO₄）和酶（例如脂肪酶）是最常用的催化剂。然而，在碱催化的酯交换反应中，碱会与游离脂肪酸反应并产生过量的肥皂和水，这会降低生物柴油的收率，并且需要复杂的分离过程。酸催化的酯交换反应需要大量过量的乙醇、高反应温度（大于100 °C）和能够承受酸催化剂腐蚀的反应器系统。为了克服这些障碍，基于脂肪酶的酶催化越来越受到关注，它已成为可持续生产生物柴油的有用绿色工具。与酸性或碱性催化剂相比，脂肪酶需要较低的反应温度和高选择性的酯交换底物，反应步骤少，产物分离度好，有害物质少，甘油纯度高，符合绿色化学要求。

微生物脂肪酶广泛用于催化酯分子的水解和无水介质中的醇解反应（如酯化和酯交换），主要用于生产药物（如手性药物拆分）、可再生燃料（如生物柴油）、食品（例如黄油和奶酪）和清洁剂。酶催化的生物柴油生产需要大量的甲醇，这会在一定程度上使脂肪酶失活并降低酶的稳定性。为了降低甲醇对酶的毒性，通常将甲醇分批加入到反应体系中，这增加了工艺步骤的数量和反应时间。因此，提高水溶性脂肪酶的催化活性和甲醇耐受性是提高生物柴油生产效率的最重要方法之一。

已经开发了各种方法来提高酶的稳定性，包括化学修饰、固定化和定向进化。半理性设计方法包括通过定向进化重新设计酶，结合改变蛋白质特性（如稳定性、立体选择性和底物特异性）的方法，通过重新设计产生新的功能。目前，半理性设计已被应用于改进用于生物柴油生产的脂肪酶的催化性能。采用添加二硫键的半理性设计方法结合迭代饱和诱变，获得了甲醇稳定性较好的突变体；在印楝油与甲醇进行酯交换24 h后，突变体实现的FAME产率约为80%。固定化Proteus mirabilis脂肪酶（PML）双突变体催化废食用油与甲醇的酯交换反应48 h，FAME产率达到93%。N-糖基化是一种主要的翻译后蛋白质修饰，影响蛋白质稳定性和与细胞或细胞间识别相关的功能。将蛋白质工程与N-糖基化修饰相结合的半理性设计方法是提高酶催化活性、热稳定性和有机溶剂稳定性的有力工具。研究发现，α-螺旋结构的N-糖基化效率较低，而β-折叠结构的N-糖基化效率较高。β-折叠也被认为具有一定程度的柔性，这可能会影响蛋白质的折叠和性能。因此，在脂肪酶的β-折叠结构中引入N-糖基化修饰，提高其活性和甲醇稳定性，可能是提高生物柴油合成效率的有效途径。

Rhizomucor miehei脂肪酶(RML)在毕赤酵母(P.Pastoris)中通常表示为带有前肽的RML(ProRML)，是制备生物柴油最常用的生物催化剂之一。为了提高脂肪酶对生物柴油生产的催化性能，使用了基于将N-糖基化修饰引入脂肪酶的β-折叠结构的ProRML定向进化。分析了获得的突变体的性质及其在使用一步甲醇进料工艺制备生物柴油中的应用。通过分子模拟研究了部分突变体在甲醇溶液中的结构变化，确定了突变体稳定性提高的原因。

N-糖基化的工程ProRML

与野生型（WT）相比，N9A/N59A表现出更好的催化活性和热稳定性，但耐甲醇性较差。构建了非糖基化的N9A/N59A为模板，在β折叠中引入了N126（W126N）、N167（P167N）、N267（R267N）、N242（L242N）和N300（P300N）五个突变体。作者使用SDS-PAGE(12%)分析了糖基化和非糖基化的ProRML。非糖基化N9A/N59A的分子量(MW)约为40 kDa，而糖突变体的MW从40到55 kDa不等。SDS-PAGE分析表明，PNGase F处理导致N126、N167、N242、N267和N300的大小减小，而N9A/N59A的MW没有变化（Fig. 1）。这些结果表明，在β-折叠结构中引入的所有N-糖基化位点都发生了N-糖基化。

糖基化ProRMLs的催化活性

N9A/N59A对pNPP的催化活性为54.45±2.49 U/mg。如Fig. 2a所示，5个突变体（N126、N167、N242、N267和N300）的催化效率显着高于N9A/N59A。突变体N167的催化活性最高（1846.12±58.56 U/mg），而N126的催化活性最差（597.09±28.46 U/mg）。与WT相比，N126、N300、N267、N242和N167位点的活性分别高出23.11、25.84、29.66、37.74和71.47倍（Fig. 2a）。结果表明，β折叠中的N-聚糖对酶活性具有积极影响，这可能是由于引入的聚糖与酶分子之间的相互作用所致。此外，研究表明，N-糖基化通过微调酶催化域的结构正向调节底物的亲和力，从而引起催化活性的变化。这种调节可以以类似于碳水化合物结合模块的方式进行，促进底物捕获和转移到酶活性位点。

N9A/N59A、N126和N242的最适pH值为8.0，而N167、N267和N300的最适pH值为7.0（Fig. 2b）。除N267和N300外，所有突变体在pH 7-8下均表现出超过85%的活性。N9A/N59A的最大活性在45 °C时达到，而糖基化突变体的最大活性在40 °C。结果表明，所有糖基化突变酶在40-45 °C的酶活性均超过80%，表明添加N-glycan几乎不会改变ProRML的最适pH和温度（Fig. 2c）。

根据Michaelis-Menten方程，ProRML突变体的K_m和V_max是在标准条件（pH 8.0, 40 °C）下使用pNPP作为底物计算的。所检测的脂肪酶的酶动力学参数见Table 2。与N9A/N59A相比，所有突变体的动力学参数都发生了变化。所有突变体的K_m和k_cat/K_m值相对于N9A/N59A增加。对于N167，催化效率(k_cat/K_m)分别比WT(90.49±2.55 min^-1mM^-1)和N9A/N59A高约51倍和32倍(Table 2)。在β-折叠结构中添加N聚糖降低了酶对底物的亲和力，但提高了其催化效率，这与酶活性的结果一致。

N9A/N59A及其糖基化突变体的热稳定性

热处理对酶活性的影响如Fig. 2e和Table 3所示。N9A/N59A的残余活性在45 °C孵育1 h后约为80%，11 h后降至64%。N267具有最好的热稳定性，在45 °C孵育1 h和11 h后，残余活性分别为95%和90%（Fig. 2d和2e）。45 ℃孵育1 h后，N126、N167、N242和N300的残留活性均高于85%，但孵育11 h后几乎完全失活。WT和N9A/N59A在45 °C(T^1/2(45 °C))下的半衰期分别为5.34和12.25 h。N242、N300和N167的T^1/2(45 °C)分别为8.34、7.07和6.10 h，均低于N9A/N59A，但高于WT。N126的T^1/2(45 °C)为3.80 h，低于WT。然而，N267的T^1/2(45 °C)为142.9 h，比N9A/N59A长138 h（Table 3）。这些结果表明，通过在β-折叠中引入N-聚糖可以大大提高ProRML的动力学稳定性，但改善程度取决于N-糖基化位点。

ProRMLs的失活曲线是通过将突变酶在35-55 °C下孵育1 h获得的（Fig. 2d）。通过分析热失活温度(T50⁶⁰)进一步评估ProRML的热稳定性。N9A/N59A的T50⁶⁰为51.86 °C。N126、N300和N267的T50⁶⁰比N9A/N59A低约2-2.5 °C，而N167和N242的T50⁶⁰高约2.5-3 °C（Table 3）。

糖基化ProRML的甲醇耐受性

突变体的活性在甲醇中显着不同（p＜0.05）。N9A/N59A在40 °C下用40%甲醇溶液处理1 h后的残留活性为48%，而在50%甲醇溶液中则显着降低至22%，几乎失去其活性（Fig. 2f）。然而，N267、N167、N300、N242和N126在50%甲醇溶液中处理1 h的残留活性分别为94%、91%、89%、85%和74%，表现出比WT更好的甲醇稳定性(22%)。此外，在90%甲醇溶液中孵育1 h后，所有糖突变体的残留活性均大于25%。N267表现出最好的甲醇稳定性，在50%甲醇溶液中孵育8 h后残留活性为64%，在90%甲醇溶液中孵育1 h后残留活性为48%，其次是N167、N242、N300和N126（Fig. 2g)。

使用糖基化ProRMLs生产生物柴油

由于其良好的甲醇耐受性，N9A/N59A和糖基化ProRML突变体N126、N167、N242、N267和N300被用于将菜籽油和废大豆油转化为生物柴油（Fig. 3）。气相色谱分析表明，N9A/N59A在48 h后将7.35%的菜籽油和7.81%的废豆油转化为生物柴油。当甲醇加入一次（甲醇与油的摩尔比为6:1）时，大多数突变体催化了大部分菜籽油和废大豆油转化为生物柴油。N267在反应24 h和48 h时，菜籽油的FAME得率分别为75.45%和99.33%，废大豆油的FAME得率分别为68.42%和81.70%，表现出最佳性能。N126表现最差，在48 h使用废豆油仅实现9.24%的FAME产率。N167、N242、N300和N306在使用菜籽油时的48 h的FAME产率为89.95%、70.76%、79.76%和71.44%，在相同时间使用废豆油的FAME产率为79.06%、67.74%、83.62%和85.97%。与菜籽油相比，废豆油的反应时间更长，转化率更低。这可能是因为废豆油中含有较多的酸性物质，降低了糖基化突变酶的酯交换反应能力。本研究中获得的突变体被用于从（废）油中生产生物柴油，采用一步甲醇进料工艺，反应48小时后转化率达到99%。该方法减少了反应时间和甲醇进料频率，简化了生产过程。此外，粗脂肪酶（发酵液）可不经纯化直接用作生物催化剂，大大降低了生产成本，具有良好的生物柴油生产前景。

阐明增强甲醇耐受性的机制

为了探索增强甲醇耐受性的机制，作者对非糖基化N9A/N59A和糖基化N267（具有最大甲醇耐受性）系统进行了MD模拟，并研究了它们在甲醇溶液中的结构变化。RMSD分析表明，N9A/N59A和N267系统在模拟过程中波动很小。N9A/N59A系统的RMSD在80 ns后增加（Fig. 4a）。N9A/N59A和N267系统的Rg值分别为1.927±0.003和1.949±0.002 nm。系统结构在模拟过程中没有表现出明显的膨胀或收缩（Fig. 4b）。与水溶剂中的Rg值相比，N9A/N59A和N267体系在甲醇溶剂中的Rg值分别降低了0.16和0.11 nm，这可能是由于甲醇和蛋白质之间的相互作用更强，导致蛋白质结构发生比较大的变化。N9A/N59A和N267系统的SASA值在模拟过程中保持稳定，平均值分别为136.19±1.08和145.97±0.87 nm²（Fig. 4c）。与水溶剂中的值相比，N9A/N59A和N267系统在甲醇溶剂中的SASA值分别低约23和20 nm²。此外，N9A/N59A系统的SASA在甲醇溶剂中表现出相对较大的变化。在甲醇溶剂中，N9A/N59A和N267体系的收敛参数达到平衡，但与水溶剂相比，系统的结构参数（Rg和SASA）发生了显着变化。N-聚糖的加入稳定了ProRML的结构，降低了甲醇溶剂对其结构的影响。

作者分析了二级结构以进一步了解引入N-聚糖对蛋白质结构的影响。N9A/N59A和N267系统的二级结构含量在模拟过程中没有明显变化，卷曲结构最丰富，其次是螺旋结构（Fig. 4d和Fig. 4e）。此外，N267系统的螺旋含量高于N9A/N59A，而卷曲含量相对较低（Table 4）。因为螺旋结构比较稳定，推断出N267系统比N9A/N59A系统更稳定。

氢键是分子间结合的主要驱动力。聚糖结构包含许多羟基，可用作氢键的供体和受体。在N267系统中，N-聚糖和蛋白质之间大约有5个氢键，N-聚糖和甲醇溶剂之间大约有39个氢键（Fig. 4f）。

N-糖基化的作用不仅限于糖基化位点，它还可以扩散到蛋白质的其他区域。Fig. 5a和5b显示了N9A/N59A和N267系统在MD模拟后的构象。在N9A/N59A系统中，Ala9和Ala59氨基酸被周围的氨基酸包裹，并与周围的氨基酸Arg6和Met56形成氢键（Fig. 5c）。此外，Ala氨基酸的侧链表现出一定的疏水性，与周围的氨基酸形成疏水相互作用，进一步稳定其结构。在N267系统中，Asn267上的修饰聚糖与脂肪酶中的许多氨基酸残基形成强氢键，包括Glu84、Glu87、Ser237、Tyr266、Glu291和Tyr293。所有带负电荷的氨基酸残基（如Glu84、Glu87和Glu291）的侧链都含有能够与聚糖结构中的羟基形成强氢键的羧基(Fig. 5d和5e)。与非糖基化的N9A/N59A相比，N267体系中的N-聚糖和脂肪酶的氨基酸可以形成更强的氢键相互作用，可以稳定附近氨基酸的形成。因此，N267的甲醇耐受性强于N9A/N59A。

整理：孙骁

文章信息：

DOI：10.1016/j.biortech.2022.126769

文章链接：https://doi.org/10.1016/j.biortech.2022.126769