梭菌属是致病菌（丁酸梭菌抑制动物致病菌实验）

摘要：探讨丁酸梭菌（CLostrdium butyricum）B1株对5种常见动物致病菌的体外拮抗作用。将丁酸梭菌分别与猪大肠杆菌（Escherichia col）K88、K99/O139株和猪肠炎沙门氏菌（Samonella enteritidis）O4HI株、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）混合接种于GAM培养基进行厌氧培养，并与致病菌菌K88、K99、O139株和猪肠炎沙门氏菌O4Hi株、金黄色葡萄球菌均有显著抑制作用。

仔猪腹泻一直是养猪生产的一大难题。并由此给猪业带来了巨大的损失。由于初生仔猪肠道微生物菌群处于形成阶段，若在饲料中添加微生物制剂，可以利用益生菌的占位效应和固本扶正的功效来调节菌群平衡，发挥生物的拮抗作用以防治仔猪腹泻，这种方法比使用抗生素和化学药物有更好的经济效益和环保效益。丁酸梭菌即酪酸菌，是一种革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌，是人和动物体内正常的有益菌群。丁酸梭菌作为人用整肠药物在日本已经有几十年的使用历史，应用效果十分显著，而把它作为动物微生态制剂的研究才刚刚起步。我们用实验室保存的丁酸梭菌B1株分别与5株猪常见致病菌共培养，通过菌落计数，证明了丁酸梭菌对这些致病菌的生物拮抗作用，为丁酸梭菌应用于猪饲料添加剂提供了一定的理论依据。

一、材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

丁酸梭菌 B1株，猪大肠杆菌K88、O139株，猪肠炎沙门氏菌O4HI株，金黄色葡萄球菌。以上均由华中农业大学农业微生物国家重点实验室提供。

1.12 培养基

梭菌增值培养基（RCM培养基）：酵母浸膏3g牛肉浸膏10g氯化钠5g三水合乙酸钠3g半胱氨酸盐酸盐0.5g0.5%美蓝0.2ml、蒸馏水1000ml；调节ph值为7.1±0.1,115℃、20min灭菌备用。GAM液体培养基（日本制药株式会社，LB固体培养基。

1.2 方法

1.21 菌种活化

丁酸梭菌活化：冻干管保藏菌株接种于装有RCM培养基的PA瓶中，置80℃水浴10min后取0.1ml转接9.9mlGAM液体培养基试管，厌氧静止培养16h。致病菌活化：将猪大肠杆菌K88株、K99株、O139株和猪肠炎沙门氏菌O4HI株、金黄色葡萄球菌冻干管分别转接LB斜面，置37℃培养48h后，取1环菌种接种于9.9mlGAM液体培养基试管，厌氧静止培养16h。

1.22 活菌计数方法

致病菌采用稀释平板计数法：将待测菌液摇匀，10倍连续稀释，选取适当的稀释度菌悬液0.1ml分贝滴加在3个LB培养基平板上，置37℃培养48h后，计算其菌数，取平均值。由于丁酸梭菌是严格厌氧菌，在有氧情况下无法长出，计数结果为致病菌菌数。

1.23 丁酸梭菌生长曲线、ph曲线测定

取25只装有9.9mlGAM液体培养基试管，将活化好的丁酸梭菌菌液稀释到10万CFU ml，取0.1ml接种到试管中，置37℃静止培养，分别在0、4、8、12、16、20、24、36、48h取出1支混匀，测活菌数和ph值、丁酸梭菌和致病菌混合培养：取10只装有9.8mlGAM液体培养基试管，将活化好的丁酸梭菌和致病菌菌液均稀释到10万 CFU ml，各取0.1ml接种到试管中，置厌氧罐37℃恒温静止培养。分别在0、4、8、12、16、20、24、36、48h取出1支混匀，测活菌数和ph值，并与单独培养的进行对照。

二、结果与分析

2.1 丁酸梭菌B1株的生长曲线和ph曲线

丁酸梭菌B1株在GAM培养基中生长良好，生长曲线和ph曲线见图1.由图1可知，菌株B1在培养基中3-4h进入对数生长期，菌数指数上升，代谢产生酸性物质，使培养基ph值也随之急速下降，对数生长长期维持约8h后进入稳定期，此后菌数不再增加，ph值稳定在46-4.7，而后在约24h时由于形成芽孢，ph值略有上升。见图1.

2.2 对大肠杆菌K88株的拮抗作用

两种菌混合培养时，由第24h开始，大肠杆菌K88的株数显著低于单独培养，到48h时，菌数差异达到两个数量级以上，说明丁酸梭菌对大肠杆菌K88株有显著抑制作用。混合培养的ph值降低速度快于单独培养、结果见图2.

2.3 对大肠杆菌K99株的拮抗作用

两种菌混合培养时，由第24h开始，大肠杆菌K99株菌数显著低于单独培养，到48h时，菌数差异达到两个数量级以上，说明丁酸梭菌对大肠杆菌K99株有显著抑制作用。结果见图3.

2.4 对大肠杆菌O139株的拮抗作用

两种菌混合培养时，大肠杆菌O139株菌数一直显著低于单独培养，特别是培养后期，菌数差异扩大到约两个数量级，说明丁酸梭菌对大肠杆菌O139株有显著的抑制作用。结果见图4.

2.5 对沙门氏菌O4Hi株的拮抗作用

两种菌混合培养时，第12h后，沙门氏菌菌数显著低于单独培养到48h时，菌数差异达到约两个数量级，说明丁酸梭菌对沙门氏菌O4Hi株有显著抑制作用。结果见图5。

2.6 对金黄色葡萄球菌的拮抗作用

两种菌混合培养时，第4h开始，金黄色葡萄球菌菌数即显著低于单独培养，到48h时，菌数差异达到约5个数量级，说明丁酸梭菌对金黄色葡萄球菌有非常强烈的抑制作用。由于金黄色葡萄球菌代谢不产酸，丁酸梭菌发酵产酸使混合培养ph值显著低于单独培养。结果见图6.

三、讨论

国内关于丁酸梭菌对人肠道致病菌的拮抗作用的研究较多，而对动物肠道致病菌的拮抗方面研究较少。有人研究发现，丁酸梭菌LCL166株与大肠菌O157株、痢疾杆菌F2a株、伤寒杆菌共培养24h，可降低致病菌数1-2个数量级。有人研究发现，丁酸梭菌LCL166株与婴儿双歧杆菌及霍乱弧菌混合培养24h时，霍乱弧菌数与单独培养相比，致病菌菌数减少4个数量级以上。在对动物致病菌拮抗方面，研究发现，丁酸梭菌RH2与猪大肠杆菌C83902，鸡大肠杆菌C83851和鸡白痢沙门氏菌Sg9以菌数比1:1共培养48h时，致病菌数与对照相比，减少6个数量级，且从共培养的第6h开始菌数差异就逐渐扩大。对于丁酸梭菌抑制致病菌的原因，大多数的研究者认为是由于丁酸梭菌生长速度快，在代谢过程中产生大量丁酸、醋酸和乳酸等有机酸，加速降低了培养基的ph值，不利于致病菌的生长所致。

我们研究发现，丁酸梭菌B1株对猪大肠杆菌K88、K99、O139株和猪肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的拮抗作用较强，共培养48h后致病菌菌数比对照降低两个数量级以上；同时还发现丁酸梭菌B1株只对金黄色葡萄球菌全程具有较强的抑制效果，而对上述其他致病菌0-24h的抑制效果不明显，24-48h抑制效果显著。为了验证是否酸抑制在丁酸梭菌抑制致病菌中起到主要作用，我们做试验的时候曾取丁酸梭菌B1株的24h发酵液对上述致病菌进行杯碟法抑菌试验，结果表明，发酵液对致病菌无明显抑制作用，与研究丁酸梭菌对大肠杆菌SW体外抑制作用结果一致。

上述结果表明：

1、丁酸梭菌对致病菌的体外拮抗作用具有菌株特异性，不同的丁酸梭菌菌株对不同来源的致病菌菌株的抑制作用差异较大。

2、丁酸梭菌发酵产生的短链脂肪酸在体外并不是抑制许多常见肠道致病菌生长的主要因素，尤其是对于那些发酵产酸较强的大肠杆菌菌株而言

3、丁酸梭菌B1株可能还产生某种未知的抑菌因子，这种因子在稳定期的后期开始生成，并很快起到强烈的抑制有害菌的作用，我们认为可能与丁酸梭菌形成芽孢过程相关联。

由于耐药性问题，抗生素在饲料中应用受到了严格的限制，因而动物微生态制剂被认为是取代抗生素最具潜力的发展方向。丁酸梭菌由于内生芽孢，对逆境的抗性较强，同时又具有强烈的调节肠道菌群平衡的益生作用，在实际应用方面具有独特的优势，本研究表明，丁酸梭菌B1株在体外对引起仔猪腹泻的常见肠道致病菌--猪大肠杆菌K88、K99、O139株和猪肠炎沙门氏菌以及有害菌金黄色葡萄球菌的拮抗作用较强，作为饲料添加剂将具有广阔的开发应用前景。

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